طريقة للحفاظ على جذور الأراضي الرطبة ورهيزوسفير للتصوير عنصري
Summary
نحن نصف بروتوكولا لعينة والحفاظ عليها وقسم الجذور سليمة والتربة رهيزوسفير المحيطة بها من بيئات الأراضي الرطبة باستخدام الأرز(Oryza sativa L.) كنوع نموذجي. وبمجرد الحفاظ عليها، يمكن تحليل العينة باستخدام تقنيات التصوير الأولي، مثل التصوير الطيفي الكيميائي synchrotron بالأشعة السينية (XRF).
Abstract
تتفاعل الجذور على نطاق واسع مع بيئة التربة الخاصة بها ولكن تصور مثل هذه التفاعلات بين الجذور ورهيزوسفير المحيطة بها أمر صعب. كيمياء رهيزوسفير من نباتات الأراضي الرطبة صعبة بشكل خاص لالتقاط بسبب تدرجات الأكسجين حاد من الجذور إلى التربة السائبة. هنا يوصف بروتوكول يحافظ بشكل فعال على بنية الجذر وكيمياء رهيزوسفير لنباتات الأراضي الرطبة من خلال تجميد البطولات الاربع وتجميد التجفيف. البطولات الاربع تجميد، حيث يتم تجميد العينة بين كتل النحاس تبريدها مسبقا مع النيتروجين السائل، ويقلل من تلف الجذر وتشويه العينة التي يمكن أن تحدث مع فلاش تجميد مع الاستمرار في تقليل التغيرات الطيف الكيميائي. في حين أن تشويه العينة لا يزال ممكنا ، والقدرة على الحصول على عينات متعددة بسرعة وبأقل تكلفة يزيد من إمكانية الحصول على عينات مرضية ويحسن وقت التصوير. وتبين البيانات أن هذه الطريقة ناجحة في الحفاظ على أنواع الزرنيخ المنخفضة في جذور الأرز ورهيزوسفيرات المرتبطة لويحات الحديد. ويمكن اعتماد هذه الطريقة لدراسات العلاقات بين النباتات والتربة في طائفة واسعة من بيئات الأراضي الرطبة التي تمتد على نطاقات تركيز من ركوب الدراجات عنصر التتبع لتطبيقات المعالجة النباتية.
Introduction
الجذور وجذورها هي دينامية، غير متجانسة، وأهمية حاسمة لفهم كيفية حصول النباتات على المواد الغذائية المعدنية والملوثات1،2،3. الجذور هي المسار الرئيسي الذي تنتقل به العناصر الغذائية (مثل الفوسفور) والملوثات (مثل الزرنيخ) من التربة إلى النباتات وبالتالي فهم هذه العملية له آثار على كمية الغذاء ونوعيته، وعمل النظام الإيكولوجي، والمعالجة النباتية. ومع ذلك، الجذور ديناميكية في المكان والزمان تنمو استجابة لاحتياجات اكتساب المغذيات وغالبا ما تختلف في وظيفة وقطرها وهيكل (على سبيل المثال، جذور الجانبية، جذور المغامرة، الشعر الجذر)2. ويمكن دراسة عدم تجانس نظم الجذر على المقاييس المكانية من الخلايا إلى مستوى النظام الإيكولوجي وعلى نطاقات زمنية من الساعة إلى العشارية. وهكذا، فإن الطبيعة الديناميكية وغير المتجانسة للجذور والتربة المحيطة بها، أو رهيزوسفير، تشكل تحديات لالتقاط كيمياء الرهيزوسفير مع مرور الوقت. وعلى الرغم من هذا التحدي، من الضروري دراسة الجذور في بيئة التربة الخاصة بهم لتوصيف هذه العلاقة الحرجة بين النباتات والتربة.
إن كيمياء الرهيزوسفير لنباتات الأراضي الرطبة تشكل تحديا خاصا للتحقيق بسبب تدرجات الأكسجين الحادة الموجودة من التربة السائبة إلى الجذور، والتي تتغير في المكان والزمان. لأن الجذور تحتاج إلى الأكسجين للتنفس، وقد تكيفت النباتات الأراضي الرطبة لظروف انخفاض الأكسجين من التربة الرطبة عن طريق خلق aerenchyma4،5. Aerenchyma هي الأنسجة القشرية المجوفة التي تمتد من يطلق النار على الجذور، مما يسمح بنشر الهواء من خلال النبات في الجذور. ومع ذلك، فإن بعض من هذا الهواء يتسرب إلى رهيزوسفير في أجزاء أقل فرعية من الجذور لا سيما بالقرب من تقاطعات الجذر الجانبي، نصائح الجذر أقل نضجا ومناطق الاستطالة6،7،8،9. هذا فقدان الأكسجين الشعاعي يخلق منطقة مؤتأكسدة في رهيزوسفير من نباتات الأراضي الرطبة التي تؤثر على الكيمياء رهيزوسفير (بيو جيو) ويختلف عن انخفاض التربة السائبة10،11،12. لفهم مصير ونقل المواد الغذائية والملوثات في رهيزوسفير الأراضي الرطبة والجذور، من الأهمية بمكان الحفاظ على التربة السائبة المنخفضة كيميائيا، ورهيزوسفير المؤأكسدة، وجذور نباتات الأراضي الرطبة لتحليلها. ومع ذلك، لأن التربة السائبة تحتوي على مكونات التربة المنخفضة التي هي حساسة للأوكسجين، يجب أن تحافظ طرق الحفاظ على الجذر والتربة على الهياكل الجذرية وتقليل ردود الفعل الحساسة للأوكسجين.
توجد طرق لإصلاح الأنسجة النباتية والحفاظ على البنية الفوقية للتصوير ، ولكن لا يمكن تطبيق هذه الأساليب للحفاظ كيميائيا على الجذور المتنامية في تربة الأراضي الرطبة. للتحقيقات حيث التوزيع عنصري فقط داخل الخلايا النباتية هو المطلوب، وعادة ما تزرع النباتات الهيدروبونية والجذور يمكن إزالتها بسهولة من الحل، ثابتة تحت ضغط عال تجميد وتجميد الاستبدال ومقسمة لمجموعة متنوعة من تطبيقات التصوير بما في ذلك عالية الدقة الطيف الكتلي الأيونات الثانوية (nanoSIMS)، المجهر الإلكتروني، وsnhrotron الأشعة السينية الفلورية (S-XRF) تحليل13، 14،15. للتحقيق في لوحة Fe على السطح الخارجي لجذور الأراضي الرطبة ، يجب أن تحفز هذه الدراسات المائية بشكل مصطنع تكوين لوحة Fe في الحل16، والتي لا تمثل بدقة عدم تجانس التوزيع والتركيب المعدني لتشكيل البلاك Fe والعناصر المرتبطة به في الموقع17و18و19و20. توجد طرق للحفاظ على التربة الرطبة والكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بها مع تجميد coring21، ولكن من الصعب الحصول على جذور مع هذه التقنية. الأساليب الحالية لتصور الجذور المتنامية في التربة وكيمياء رهيزوسفيرها تتكون من نوعين من أنواع القياس الأولية: التدفقات الأولية والتركيز الأساسي الكلي (والتكهنات). يتم قياس الأول عادة باستخدام تدرجات الانتشار في الأفلام الرقيقة (DGT)22،23،24، حيث يتم وضع التربة في صناديق رهيزوبوكس لدعم نمو النبات في إعداد المختبر وعناصر الشفرين في التربة المنتشرة من خلال هلام في طبقة ملزمة. ويمكن بعد ذلك تصوير هذه الطبقة الملزمة لتحديد العناصر الشفهية ذات الاهتمام. هذه التقنية يمكن أن توضح بنجاح العلاقات بين الجذور ورهيزوسفير24،25،26،27، ولكن قد توجد القطع الأثرية من الجذر يحدها النباتات المتنامية في rhizoboxes ، ولا يتم التقاط المعلومات عن باطن الجذر مع DGT. ويشمل هذا الأخير أخذ عينات من الجذور ورهيزوسفير، والحفاظ على العينة، وتحليل التوزيع الأولي مباشرة على قسم العينة. لهذه العينة البيئية من جذور النباتات الأراضي الرطبة ورهيزوسفير المحيطة بها، مطلوب التعامل مع عينة دقيقة لتجنب القطع الأثرية من إعداد العينة.
هنا يوصف بروتوكول يحافظ بشكل فعال على هياكل الجذر وكيمياء الرهيزوسفير لنباتات الأراضي الرطبة عن طريق تجميد البطولات الاربع وتجميد التجفيف. يمكن أن يؤدي تجميد الفلاش إلى إبطاء التحولات في المذابات الحساسة للأوكسجين بشكل كبير ولكنه قد يضر بالجذور وقد يسبب التعبئة عندما تجف العينات. ومع ذلك، البطولات الاربع تجميد حيث يتم تجميد العينة بين كتل النحاس تبريد مسبق مع النيتروجين السائل يقلل من تلف الجذر وتشويه العينة28. ثم يتم تضمين العينات المحفوظة في راتنج الايبوكسي الذي يحافظ على الطيف20،29 ويمكن قطع ومصقول لتصوير الجذور داخل التربة rhizosphere بهم. تم تحليل العينات في هذا التقرير من قبل التصوير الطيف الكيميائي S-XRF بعد تقسيم رقيقة. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام تقنيات تصوير أخرى، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي للبلازما المقترن بالاجتثاث بالليزر (LA-ICP-MS)، وانبعاثات الأشعة السينية الناجمة عن الجسيمات (PIXE)، وقياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي (SIMS)، والتصوير الطيفي للانهيار الناجم عن الليزر (LIBS).
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة بروتوكولا للحصول على التربة السائبة المحفوظة + رهيزوسفير جذور نبات الأراضي الرطبة باستخدام تقنية تجميد البطولات الاربع التي يمكن استخدامها للتصوير عنصري و / أو رسم خرائط المواصفات الكيميائية.
هناك العديد من الفوائد من هذا الأسلوب على الأساليب الموجودة. أولا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعترف المؤلفان بمنحة بذور مشتركة إلى سيفرث وطابيرو لدعم التعاون بين مختبر جامعة ديلاوير وبروكهافن الوطني. استخدمت أجزاء من هذا البحث خط شعاع XFM (4-BM) من مصدر ضوء السنكروترون الوطني II ، وهو مكتب وزارة الطاقة الأمريكية (DOE) لمرفق مستخدمي العلوم الذي يعمل لمكتب وزارة الطاقة للعلوم من قبل مختبر بروكهافن الوطني بموجب العقد رقم DE-SC0012704.
Materials
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
References
- Ahkami, A. H., White, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere. 3 (2), 233-243 (2017).
- McNear, D. H. The rhizosphere – roots, soil and everything in between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Armstrong, W., Justin, S., Beckett, P. M., Lythe, S. Root adaptation to soil waterlogging. Aquatic Botany. 39 (1-2), 57-73 (1991).
- Armstrong, W. Oxidising activity of roots in waterlogged soils. Physiologia Plantarum. 20 (4), 920-926 (1967).
- Armstrong, W. Oxygen diffusion from roots of some Brittish bog plants. Nature. 204 (496), 801-802 (1964).
- Li, H., Ye, Z. H., Wei, Z. J., Wong, M. H. Root porosity and radial oxygen loss related to arsenic tolerance and uptake in wetland plants. Environmental Pollution. 159 (1), 30-37 (2011).
- Kotula, L., Ranathunge, K., Steudle, E. Apoplastic barriers effectively block oxygen permeability across outer cell layers of rice roots under deoxygenated conditions: roles of apoplastic pores and of respiration. New Phytologist. 184 (4), 909-917 (2009).
- Mei, X. Q., Ye, Z. H., Wong, M. H. The relationship of root porosity and radial oxygen loss on arsenic tolerance and uptake in rice grains and straw. Environmental Pollution. 157 (8-9), 2550-2557 (2009).
- Khan, N., et al. Root Iron Plaque on Wetland Plants as a Dynamic Pool of Nutrients and Contaminants. Advances in Agronomy. 138, 1-96 (2016).
- Yamaguchi, N., Ohkura, T., Takahashi, Y., Maejima, Y., Arao, T. Arsenic Distribution and Speciation near Rice Roots Influenced by Iron Plaques and Redox Conditions of the Soil Matrix. Environmental Science and Technology. 48 (3), 1549-1556 (2014).
- Frommer, J., Voegelin, A., Dittmar, J., Marcus, M. A., Kretzschmar, R. Biogeochemical processes and arsenic enrichment around rice roots in paddy soil: results from micro-focused X-ray spectroscopy. European Journal of Soil Science. 62 (2), 305-317 (2011).
- Moore, K. L., et al. Combined NanoSIMS and synchrotron X-ray fluorescence reveal distinct cellular and subcellular distribution patterns of trace elements in rice tissues. New Phytologist. 201 (1), 104-115 (2014).
- vander Ent, A., et al. X-ray elemental mapping techniques for elucidating the ecophysiology of hyperaccumulator plants. New Phytologist. 218 (2), 432-452 (2018).
- Sarret, G., Smits, E. A. H. P., Michel, H. C., Isaure, M. P., Zhao, F. J., Tappero, R. Use of Synchrotron-Based Techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advances in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Moore, K. L., et al. High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry Reveals the Contrasting Subcellular Distribution of Arsenic and Silicon in Rice Roots. Plant Physiology. 156 (2), 913-924 (2011).
- Seyfferth, A. L. Abiotic effects of dissolved oxyanions on iron plaque quantity and mineral composition in a simulated rhizosphere. Plant and Soil. 397 (1-2), (2015).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Arsenic localization, speciation, and co-occurrence with iron on rice (Oryza sativa L) roots having variable Fe coatings. Environmental Science and Technology. 44 (21), (2010).
- Amaral, D. C., Lopes, G., Guilherme, L. R. G., Seyfferth, A. L. A new approach to sampling Iintact Fe plaque reveals Si-induced changes in Fe mineral composition and shoot As in rice. Environmental Science and Technology. 51 (1), 38-45 (2017).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Defining the distribution of arsenic species and plant nutrients in rice (Oryza sativa L.) from the root to the grain. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (21), (2011).
- Franchini, A. G., Zeyer, J. Freeze-Coring Method for Characterization of Microbial Community Structure and Function in Wetland Soils at High Spatial Resolution. Applied and Environmental Microbiology. 78 (12), 4501-4504 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized Flux Maxima of Arsenic, Lead, and Iron around Root Apices in Flooded Lowland Rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Seyfferth, A. L., Ross, J., Webb, S. M. Evidence for the root-uptake of arsenite at lateral root junctions and root apices in rice (Oryza sativa L.). Soil Processes. 1, 3 (2017).
- Masue-Slowey, Y., Kocar, B. D., Jofre, S. A. B., Mayer, K. U., Fendorf, S. Transport Implications Resulting from Internal Redistribution of Arsenic and Iron within Constructed Soil Aggregates. Environmental Science and Technology. 45 (2), 582-588 (2011).
- Root, R. A., Fathordoobadi, S., Alday, F., Ela, W., Chorover, J. Microscale Speciation of Arsenic and Iron in Ferric-Based Sorbents Subjected to Simulated Landfill Conditions. Environmental Science and Technology. 47 (22), 12992-13000 (2013).
- Blute, N. K., Brabander, D. J., Hemond, H. F., Sutton, S. R., Newville, M. G., Rivers, M. L. Arsenic sequestration by ferric iron plaque on cattail roots. Environmental Science and Technology. 38 (22), 6074-6077 (2004).
- Hansel, C. M., La Force, M. J., Fendorf, S., Sutton, S. Spatial and temporal association of As and Fe species on aquatic plant roots. Environmental Science and Technology. 36 (9), 1988-1994 (2002).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Maisch, M., Lueder, U., Kappler, A., Schmidt, C. Iron Lung: How Rice Roots Induce Iron Redox Changes in the Rhizosphere and Create Niches for Microaerophilic Fe(II)-Oxidizing Bacteria. Environmental Science and Technology Letters. 6 (10), 600-605 (2019).
- Voegelin, A., Weber, F. -. A. A., Kretzschmar, R. Distribution and speciation of arsenic around roots in a contaminated riparian floodplain soil: Micro-XRF element mapping and EXAFS spectroscopy. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 71 (23), 5804-5820 (2007).
- Smith, E., Kempson, I., Juhasz, A. L., Weber, J., Skinner, W. M., Grafe, M. Localization and speciation of arsenic and trace elements in rice tissues. Chemosphere. 76 (4), 529-535 (2009).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Echlin, P., Lai, C., Hayes, T., Saubermann, A. Cryofixation of Lemna-minor roots for morphological and analytical studies. Cryoletters. 1 (9), 289-300 (1980).
- Ma, R., Shen, J. L., Wu, J. S., Tang, Z., Shen, Q. R., Zhao, F. J. Impact of agronomic practices on arsenic accumulation and speciation in rice grain. Environmental Pollution. 194, 217-223 (2014).
- Chen, Z., Zhu, Y. G., Liu, W. J., Meharg, A. A. Direct evidence showing the effect of root surface iron plaque on arsenite and arsenate uptake into rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist. 165 (1), 91-97 (2005).
- Lee, C. H., Hsieh, Y. C., Lin, T. H., Lee, D. Y. Iron plaque formation and its effect on arsenic uptake by different genotypes of paddy rice. Plant and Soil. 363 (1-2), 231-241 (2013).
- Seyfferth, A. L., Amaral, D. C., Limmer, M. A., Guilherme, L. R. G. Combined impacts of Si-rich rice residues and flooding extent on grain As and Cd in rice. Environment International. 128, 301-309 (2019).
- Seyfferth, A., Limmer, M., Wu, W. Si and Water Management Drives Changes in Fe and Mn Pools that Affect As Cycling and Uptake in Rice. Soil Systems. 3 (3), (2019).
- Limmer, M. A., Mann, J., Amaral, D. C., Vargas, R., Seyfferth, A. L. Silicon-rich amendments in rice paddies: Effects on arsenic uptake and biogeochemistry. Science of the Total Environment. 624, 1360-1368 (2018).
