We beschrijven een protocol om veranderingen in de activiteit van het afferente neuron te volgen tijdens motorische commando’s in een model gewerveld haarcelsysteem.
Sensorische systemen verzamelen signalen die essentieel zijn voor het sturen van gedrag, maar dieren moeten ontcijferen welke informatie biologisch relevant is. Voortbeweging genereert reafferent signalen die dieren moeten ontwarren van relevante zintuiglijke signalen van de omgeving. Wanneer een vis bijvoorbeeld zwemt, wordt de stroom die wordt gegenereerd door lichaamsgolvingen gedetecteerd door de mechanoreceptieve neuromasten, bestaande uit haarcellen, die het laterale lijnsysteem vormen. De haarcellen sturen vervolgens vloeibare bewegingsinformatie van de sensor naar de hersenen via de sensorische afferente neuronen. Tegelijkertijd wordt de uitvloeiing van het motorcommando doorgegeven aan haarcellen om sensorische overbelasting te voorkomen. Het remmende effect van voorspellende motorische signalen tijdens de voortbeweging is daarom van cruciaal belang bij het evalueren van de gevoeligheid van het laterale lijnsysteem. We hebben een in vivo elektrofysiologische benadering ontwikkeld om tegelijkertijd posterieure laterale lijnafferente neuron en ventrale motorische wortelactiviteit bij zebravislarven (4-7 dagen na bevruchting) te monitoren die enkele uren kan duren. Extracellulaire opnames van afferent neuronen worden bereikt met behulp van de losse patch clamp techniek, die activiteit van enkele of meerdere neuronen kan detecteren. Ventrale wortelopnamen worden uitgevoerd door de huid met glazen elektroden om motorneuronactiviteit te detecteren. Ons experimentele protocol biedt het potentieel om endogene of opgeroepen veranderingen in sensorische input over motorisch gedrag te volgen in een intact, gewerveld gewerveld gedrag.
Afferent neuronen van mechanosensorische systemen verzenden informatie van haarcellen naar de hersenen tijdens het gehoor en evenwicht. Elektrofysiologie kan de gevoeligheid van afferente neuronen onthullen door middel van directe opnames. Hoewel hele celpatches van haarcellen een uitdaging kunnen zijn, is het opnemen van downstream afferente neuronen gemakkelijker en maakt het mogelijk om actiepotentiaal te beoordelen als reactie op gecontroleerde stimulaties1,2,3. Stimulerende haarcellen leiden tot hun afbuiging, die mechanosensorische structuren wijzigt, waardoor een toename van actiepotentiaal (spikes) in afferente neuronen4,5,6wordt geactiveerd . Bij afwezigheid van externe stimuli pieken afferente neuronen ook spontaan als gevolg van glutamaatlek uit de haarcellen op afferent post-synaptische terminals7,8, en is aangetoond dat ze bijdragen aan het handhaven van gevoeligheid9,10. Patchklemregistratie van afferente activiteit maakt observatie van haarcelgevoeligheid en signaaldynamiek mogelijk die niet mogelijk zijn met behulp van technieken met een lagere temporele resolutie, zoals in microfonica11,12 of functionele calciumbeeldvorming13,14,15. Het volgende protocol zal het mogelijk maken om afferente activiteit gelijktijdig met motorische commando’s te registreren om onmiddellijke veranderingen in de gevoeligheid van haarcellen te onthullen.
Zebravissen (Danio rerio) gebruiken haarcellen in neuromasten die het laterale lijnsysteem samenstellen om waterbeweging ten opzichte van hun lichaam te detecteren, wat wordt vertaald in neurale signalen die essentieel zijn voor navigatie16,17,18,roofdiervermijding, prooivangst19,20en scholing21. De waterstroom kan ook zelf worden gegenereerd door de bewegingen van zwemmen22,23,24,ademhaling22,25,26en voeding27. Dit gedrag bestaat uit repetitieve bewegingen die haarcellen kunnen vermoeien en de gevoeligheid kunnen aantasten. Daarom is het van cruciaal belang dat het laterale lijnsysteem onderscheid maakt tussen externe (exafferent) en zelfgegenereerde (reafferent) stroomprikkels. Een uitvloeiing dempt zelfgegenereerde stroomsignalen tijdens voortbeweging bij zebravissen. Dit remmende voorspellende motorsignaal wordt via dalende neuronen doorgegeven aan de sensorische receptoren om de input te wijzigen of de verwerking van de reafferent feedback28,29te onderbreken . Baanbrekend werk dat bijdroeg aan ons vroege begrip van dit feedforward-systeem was gebaseerd op in vitro preparaten waarbij de connectiviteit en endogene activiteit van het neurale circuit niet werden gehandhaafd28,30,31,32,33,34,35. Dit protocol beschrijft een benadering van het behoud van een intact neuraal circuit waar endogene feedbackdynamiek wordt gehandhaafd, waardoor een beter begrip van de uitvloeiing in vivo mogelijk wordt.
Het hier geschetste protocol beschrijft hoe posterieure laterale lijn afferent neuron en motorneuron activiteit tegelijkertijd in larvale zebravissen te controleren. Het karakteriseren van afferente signaaldynamiek voor, tijdens en na motorische commando’s geeft inzicht in real-time, endogene feedback van het centrale zenuwstelsel die de gevoeligheid van haarcellen tijdens de voortbeweging moduleert. Dit protocol beschrijft welke materialen voorafgaand aan experimenten moeten worden voorbereid en beschrijft vervolgens hoe zebravislarven kunnen worden verlamd en voorbereid. Het protocol zal beschrijven hoe een stabiele losse patchopname van afferent neuronen en extracellulaire ventrale wortel (VR) opnames van motorneuronen tot stand kan worden brengen. Representatieve gegevens die met behulp van dit protocol kunnen worden verkregen, worden gepresenteerd door een voorbeeldig individu en de analyse is uitgevoerd op meerdere replica’s van het experimentele protocol. Voorverwerking van gegevens wordt uitgevoerd met behulp van aangepaste geschreven scripts in MATLAB. Over het algemeen is dit in vivo experimentele paradigma klaar om een beter begrip te geven van sensorische feedback tijdens voortbeweging in een model gewerveld haarcelsysteem.
Het beschreven experimentele protocol biedt het potentieel om endogene veranderingen in sensorische input over motorisch gedrag te monitoren in een intact, gewerveld gewerveld gedrag. In het bijzonder beschrijft het een in vivo benadering van het uitvoeren van gelijktijdige extracellulaire opnames van laterale lijnafferente neuronen en ventrale motorwortels bij larvale zebravissen. Spontane afferente activiteit werd eerder gekarakteriseerd bij zebravissen zonder rekening te houden met potentiële gelijktijdige motorische…
The authors have nothing to disclose.
We erkennen dankbaar de steun van het National Institute of Health (DC010809), National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) en het Whitney Laboratory for Marine Biosciences aan J.C.L. We willen voormalige en huidige leden van het Liao Lab bedanken voor het stimuleren van discussies.
100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
computer | N/A | N/A | any computer should work |
DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |