Оценка белковых взаимодействий в живых клетках с FRET-сенсибилизированным излучением
Summary
Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) между двумя молекулами флуорофора может быть использован для изучения белковых взаимодействий в живой клетке. Здесь представлен протокол о том, как измерять FRET в живых клетках путем обнаружения сенсибилизированного излучения акцептора и гашения донорной молекулы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Abstract
Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) представляет собой безрадиационный перенос энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния и ориентации молекул, а также от степени перекрытия между спектрами донорского излучения и акцепторного поглощения. FRET позволяет изучать взаимодействие белков в живой клетке с течением времени и в различных субклеточных компартментах. В литературе описаны различные алгоритмы измерения FRET с помощью микроскопии, основанные на интенсивности. Здесь представлены протокол и алгоритм для количественной оценки эффективности FRET, основанные на измерении как сенсибилизированного излучения акцептора, так и гашения молекулы-донора. Количественная оценка ратиометрического FRET в живой клетке требует не только определения перекрестных помех (спектрального перелива или утечки) флуоресцентных белков, но и эффективности обнаружения микроскопической установки. В приведенном здесь протоколе подробно описано, как оценить эти критические параметры.
Introduction
Анализ резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) на основе микроскопии позволяет оценить взаимодействия между белками в живых клетках. Он предоставляет пространственную и временную информацию, включая информацию о том, где в клетке и в каком субклеточном компартменте происходит взаимодействие, и изменяется ли это взаимодействие с течением времени.
Теодор Фёрстер заложил теоретическую основу FRET в 1948 году1. FRET представляет собой безрадиационную передачу энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния между молекулами и относительной ориентации их переходных диполей, а также от перекрытия между спектрами донорского излучения и акцепторного поглощения. Скорость передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния донор-акцептор. Таким образом, FRET можно использовать для измерения молекулярной близости в диапазоне 1-10 нм.
FRET конкурирует с другими процессами девозбуждения молекулы-донора и приводит к так называемому донор-гашению и сенсибилизированному излучению акцептора. Донорное гашение — это уменьшение количества испускаемых фотонов-доноров, в то время как сенсибилизированное излучение — увеличение испускаемых акцепторных фотонов. Во многих микроскопических анализах FRET используются измерения интенсивности флуоресценции, включая акцепторное фотообесцвечивание 2, донорское фотообесцвечивание2 или FRET-сенсибилизированное фотообесцвечивание акцептора3.
Здесь представлен пошаговый экспериментальный протокол и математический алгоритм для количественной оценки FRET с использованием донорного гашения и акцепторно-сенсибилизированного излучения4,5, метода, часто называемого ратиометрическим FRET. Было опубликовано много протоколов о том, как аппроксимировать сенсибилизированное излучение, лишь немногие количественно определили абсолютную эффективность FRET 6,7,8,9. Количественная оценка эффективности FRET в живой клетке требует определения (i) перекрестных помех (спектрального перелива или утечки) флуоресцентных белков, а также (ii) эффективности обнаружения микроскопической установки. В то время как перекрестные помехи могут быть оценены путем визуализации клеток, экспрессирующих только один из флуорофоров, оценка относительной эффективности обнаружения донорской и акцепторной флуоресценции является более сложной. Это требует знания, по крайней мере, соотношения числа молекул-доноров и акцепторов, порождающих измеряемые сигналы. Однако количество флуорофоров, экспрессируемых в живых клетках, варьируется от клетки к клетке и неизвестно. Так называемый фактор α характеризует относительную силу сигнала от одной возбужденной молекулы-донора и акцептора. Знание фактора является необходимым условием для количественных измерений коэффициентометрического FRET в образцах с переменным отношением акцепторных и донорных молекул, как это происходит во время визуализации живых клеток флуоресцентными белками. Использование белка слияния донора-акцептора 1 к 1 в качестве калибровочного зонда позволяет определить фактор α, а также служит положительным контролем. Этот генетически связанный зонд экспрессируется клетками в неизвестных общих количествах, но в фиксированном и известном относительном количестве один к одному. В следующем протоколе изложено, как построить зонд 1-к-1 и как использовать его для количественной оценки эффективности FRET. Электронная таблица, включающая все формулы, может быть найдена в приложении и может использоваться читателями для ввода своих собственных измерений в соответствующие столбцы, как указано ниже.
В то время как протокол использует пару донор/акцептор GFP-Cherry, представленный подход может быть выполнен с любой другой парой FRET. Дополнительный файл 1 содержит подробную информацию о голубо-желтых парах.
Protocol
Representative Results
Discussion
В представленном протоколе подробно описано использование генетически связанного взаимно-однозначного калибровочного зонда флуоресцентного белка для количественной оценки FRET с использованием детектирования сенсибилизированного излучения акцептора и гашения донорной молекулы ме…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Службу визуализации неврологии в Медицинской школе Стэнфордского университета за предоставление оборудования и места для этого проекта. Это исследование было поддержано очным финансированием Стэнфордского института рака и отделения гинекологической онкологии Стэнфорда, а также GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 от Национального управления исследований, разработок и инноваций, Венгрия.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
References
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
- Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
- van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
- Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
- Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
- Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 33-38 (1996).
- Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
- Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
- Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
- Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
- Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
- Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
- McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
- Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
- Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
- King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).
