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Behavior

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Published: April 04, 2021
doi:
10.3791/62244
, , , ,
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics,The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics,University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

Este estudo apresenta protocolos para duas abordagens semi-automatizadas de análise de atividade locomotor em C. elegans complexo I disease gas-1(fc21) worms, ou seja, ZebraLab (um ensaio de rendimento médio) e WormScan (um ensaio de alto rendimento) e fornecem análise comparativa entre uma ampla gama de métodos de pesquisa para quantificar o comportamento nematoides e função neuromuscular integrada.

Abstract

Caenorhabditis elegans é amplamente reconhecido por sua utilidade central como um modelo animal translacional para interrogar eficientemente mecanismos e terapias de diversas doenças humanas. Os vermes são particularmente adequados para telas genéticas e medicamentosas de alto rendimento para obter uma visão mais profunda sobre alvos e terapias terapêuticas, explorando seu ciclo de desenvolvimento rápido, grande tamanho de ninhada, vida útil curta, transparência microscópica, baixos custos de manutenção, conjunto robusto de ferramentas genômicas, repositórios mutantes e metodologias experimentais para interrogar tanto na si vivo quanto na fisiologia ex. A atividade locomotor de vermes representa um fenótipo particularmente relevante que é frequentemente prejudicado na doença mitocondrial, que é altamente heterogênea em causas e manifestações, mas compartilha coletivamente uma capacidade prejudicada de produzir energia celular. Embora um conjunto de diferentes metodologias possam ser usadas para interrogar o comportamento dos vermes, estes variam muito em custos experimentais, complexidade e utilidade para telas genômicas ou de alto rendimento. Aqui, foram comparadas as relativas rendimentos, vantagens e limitações de 16 metodologias diferentes de análise de atividade que quantificam a locomoção de nematoides, a surra, o bombeamento farínngeal e/ou a quimiotaxis em vermes únicos ou populações de vermes de C. elegans em diferentes estágios, idades e durações experimentais. Protocolos detalhados foram demonstrados para dois métodos semi-automatizados para quantificar a atividade locomotor nematode que representam novas aplicações de ferramentas de software disponíveis, ou seja, ZebraLab (uma abordagem de throughput médio) e WormScan (uma abordagem de alto rendimento). Os dados da aplicação desses métodos demonstraram graus semelhantes de redução da atividade animal ocorrida na fase larval L4, e progrediram no primeiro dia de adultos, no complexo mitocondrial I doença(gás-1(fc21)vermes mutantes relativos ao tipo selvagem (N2 Bristol) C. elegans. Esses dados validam a utilidade para essas novas aplicações de uso das ferramentas de software ZebraLab ou WormScan para quantificar a atividade locomotor de worm de forma eficiente e objetiva, com capacidade variável para suportar o rastreamento de drogas de alto rendimento no comportamento dos vermes em modelos animais pré-clínicos da doença mitocondrial.

Introduction

Caenorhabiditis elegans é amplamente reconhecido como um modelo excepcional na neurociência com base em ter 302 neurônios que coordenam todos os comportamentos de vermes, incluindo acasalamento, alimentação, colocação de ovos, defecação, natação e locomoção em mídia sólida1. Estes nematoides hermafroditas também são amplamente utilizados para entender uma ampla gama de mecanismos de doença humana, possibilitados por seu genoma bem caracterizado e alta homologia de ~80% de genes entre C. elegans e humanos2,3,4. C. elegans têm sido usados há muito tempo para interrogar a doença mitocondrial humana5,6,7,8,9,10, que é um grupo altamente geneticamente e fenotipicamente heterogêneo de distúrbios metabólicos herdados que compartilham capacidade prejudicada para gerar energia celular e muitas vezes clinicamente presente com função neuromuscular substancialmente prejudicada, intolerância ao exercício e fadiga11 ,12,13,14. Para isso, o uso de modelos C. elegans permite modelagem pré-clínica de aspectos quantitativos da atividade animal e função neuromuscular em diferentes subtipos genéticos da doença mitocondrial, bem como sua resposta a terapias candidatas que podem melhorar sua função neuromuscular e atividade geral.

A atividade neuromuscular em C. elegans é objetivamente mensurável por uma série de metodologias experimentais, incluindo abordagens manuais e semi-automatizadas que permitem análises funcionais em mídia sólida ou líquida(Tabela 1)1,15. A quantitação precisa da atividade de C. elegans tem se mostrado importante para permitir descobertas relacionadas à função e desenvolvimento do sistema muscular e nervoso16,17,18. Este estudo resume e compara requisitos experimentais, vantagens e limitações de 17 ensaios diferentes que podem ser realizados em laboratórios de pesquisa para avaliar a função neuromuscular e a atividade em quatro desfechos fundamentais em modelos de doenças C. elegans, tanto na linha de base em uma gama de estágios e idades do desenvolvimento, bem como em resposta às terapias dos candidatos (Tabela 1 ). De fato, o estudo fornece uma visão geral detalhada da gama de abordagens experimentais disponíveis para caracterizar taxas de C. elegans thrashing (dobras corporais por minuto), atividade locomotor, bombeamento farínngeal e quimiotaxis – em cada caso especificando a metodologia experimental e analítica utilizada, as vantagens e limitações de cada método, o equipamento e software necessários para executar e analisar cada ensaio, e a capacidade de rendimento de cada método para apoiar seu uso para fins de triagem genética ou medicamentosa de alto rendimento. A capacidade de rendimento de cada ensaio é descrita como baixa, média ou alta com base na complexidade experimental do protocolo, incluindo manutenção de vermes, tempo de processamento, uso de placas únicas ou multi-poços e/ou tempo de experimentador necessário para completar a configuração experimental e análises de dados.

As análises manuais de thrashing19, atividade locomotor20,bombeamento faríndico17,21, equimiotaxis 22,23 são metodologias bem estabelecidas para avaliar a atividade do verme que requerem um estereomicroscope24. Embora medir a atividade de desbaste de vermes requer análise em mídia líquida para determinar a frequência de dobras corporais por minuto, a atividade locomotor de vermes pode ser medida tanto em mídia sólida quanto em mídia líquida. No entanto, as análises manuais da atividade individual do worm são inerentemente demoradas e envolvem viés inevitável gerado pelo usuário. A automação das análises de atividade de worm minimiza o viés gerado pelo usuário e pode aumentar consideravelmente o throughput experimental25. Gravações de vídeo de atividade de espancamento de worms em mídia líquida podem ser analisadas usando wrMTrck, um plugin ImageJ26. No entanto, as configurações experimentais originais que foram desenvolvidas para o wrMTrck limitaram sua utilidade, uma vez que muitos worms em uma única gota líquida levaram à sobreposição de worms que dificultavam o rastreamento preciso. Embora essa limitação experimental tenha sido resolvida27,o método wrMTrck não é capaz de suportar a triagem de alto rendimento.

Existem uma série de métodos para quantificar a atividade locomotor de vermes na linha de base e em resposta às terapias candidatas em modelos de doença mitocondrial C. elegans. Estes incluem ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, ampla plataforma de rastreamento de nematoides de campo de visão (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30,WormLab31, Infinity Chip32e WMicrotracker One33 (Tabela 1). Esses métodos permitem a análise simultânea da locomoção em múltiplas cepas ou condições de vermes, tipicamente em placas de vários poços, suportando assim aplicações de triagem de medicamentos de maior rendimento. Alguns desses métodos têm considerações únicas que podem limitar ou melhorar sua utilidade geral, como a necessidade de equipamentos caros versus software de acesso aberto e a facilidade variada de executar protocolos experimentais. No geral, nenhum sistema ou protocolo experimental único é ideal para todos os experimentos de atividade locomotor de C. elegans. Em vez disso, é importante escolher cuidadosamente qual método é mais adequado para as metas e requisitos experimentais do investigador específico.

O bombeamento faringeal representa outro resultado importante para avaliar a atividade neuromuscular em C. elegans. A faringe C. elegans é composta por 20 células musculares, 20 neurônios e 20 outras células que permitem a ingestão de Escherichia coli (E. coli)na extremidade anterior do trato alimentar do verme34,35,36. Vários métodos manuais foram estabelecidos para determinar as taxas de bombeamento faringeal17,21,37,38. A maioria dos métodos baseia-se no uso de um estereómico e câmera para visualizar e registrar a frequência de bombeamento faringeal com contagem direta pelo observador experimental21. A análise automatizada da taxa de bombeamento faringeal é possível realizando um registro extracelular denominado eletrofarngeoograma (EPG), que fornece informações adicionais sobre a duração de cada bomba39. A análise da taxa de bombeamento faringeal também é possível em um sistema microfluido, WormSpa, onde vermes individuais estão confinados nas câmaras40,41. Um método comercial disponível para facilitar a análise da taxa de bomba faríneal é o ScreenChip System (InVivo Biosystems), que mede, visualiza e analisa os aspectos neuromusculares do comportamento alimentar em um único verme que é imobilizado em um chip personalizado. Essa abordagem de quantitação de bombeamento faringeal pode ser usada para avaliar tanto as respostas neuronais quanto fisiológicas às drogas, ao envelhecimento e a outros fatores42,43,44,45.

A quimiotaxis descreve o movimento de C. elegans em resposta a um odorlante colocado longe dos vermes em uma área definida da placa de mídia de crescimento nematoide (NGM). Avaliar a resposta da quimiotaxis fornece uma medida integrada de atividade neuronal e neuromuscular de vermes que é quantificável observando e medindo a distância física percorrida por vermes em direção ao odorno em um período de tempo definido46. O Multi-Worm Tracker é um método automático que pode ser usado para melhorar a eficiência experimental de quantificar a distância percorrida por worms em direção a um atrativo ou de um repelente47.

Aqui, o protocolo detalhado para dois novos métodos semi-automatizados estabelecidos para quantificar a atividade do worm é descrito. A primeira abordagem utiliza o ZebraLab, um software comercial que foi originalmente desenvolvido para estudar a atividade de natação de Danio rerio (zebrafish), para um novo aplicativo de médio-rendimento para quantificar a atividade locomotor global em mídia líquida de C. elegans com base em mudanças de pixels durante o movimento(Tabela 1, Figura 1). A saída de dados é rapidamente obtida a partir de um grande número de condições simultâneas e amostras analisadas em um slide de vidro, embora este método não seja adequado para um formato de placa multi-poço. A segunda abordagem é uma nova adaptação da metodologia WormScan48,49 ( Figura2), que usa um scanner de plataforma para criar uma imagem diferencial de dois scans sequenciais que podem ser variadamente utilizados com software de código aberto para permitir a análise quantitativa semi-automatizada de desfechos fisiológicos integrados, como fecundidade e sobrevivência. Aqui, foi desenvolvida uma nova adaptação de alto rendimento da metodologia WormScan para quantificar a atividade locomotor de vermes em mídia líquida em populações de quinze vermes larval estágio 4 (L4) por poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Esta metodologia wormScan semi-automatizada e de baixo custo pode ser prontamente adaptada a telas de drogas de alto rendimento, bem como a análises de vários estágios animais e idadesde 48,49anos .

Aqui, o protocolo e a eficácia da análise da atividade locomotor C. elegans utilizando métodos semi-automatizados ZebraLab e WormScan são demonstrados em um modelo C. elegans bem estabelecido para doença do complexo mitocondrial I, gas-1(fc21). gas-1 (gene K09A9.5) é uma ortopedia do NDUFS2 humano (NADH: ubiquinone oxidoreductase core (proteína ferro-enxofre) subunita 2)(Figura 3). A cepa mutante C. elegans gas-1(fc21) carrega uma mutação homozigosa p.R290K missense no topiche humano de NDUFS250,causando significativamente diminuição da fecundidade e da vida útil, capacidade de fosforilação oxidativa da cadeia respiratória prejudicada (OXPHOS) capacidade51, bem como diminuição da massa mitocondrial e potencial de membrana com aumento do estresse oxidativo5,8 . Apesar de seu uso bem estabelecido nas últimas duas décadas para estudar doença mitocondrial, a atividade locomotor de mutantes gas-1(fc21)não foi relatada anteriormente. Aqui, os métodos ZebraLab e WormScan foram aplicados para quantificar independentemente a atividade locomotor do gás-1(fc21) em comparação com vermes do tipo selvagem (WT, N2 Bristol), tanto como uma forma de validar os métodos quanto de demonstrar sua utilidade comparativa e eficiência dos protocolos experimentais e análises de informática. O software ZebraLab permitiu a rápida quantitação de várias condições simultâneas de atividade locomotor de vermes em modelos de doença mitocondrial C. elegans, com potencial aplicação para estudos de triagem ou validação de medicamentos direcionados. A análise do WormScan, em particular, é adequada para permitir prontamente telas de medicamentos de alto rendimento de bibliotecas compostas e priorizar leads que melhorem a função neuromuscular animal e a atividade locomotor em modelos pré-clínicos de C. elegans da doença mitocondrial primária.

Protocol

1. Análise de atividade locomotor worm em mídia líquida em lâminas de vidro usando software ZebraLab Crescimento e manuseio de nematoides Cresça C. elegans em placas de Petri contendo mídia de crescimento de nematode (NGM) e espalhe-se com Escherichia coli OP50 como fonte de alimento. Mantenha a cultura dos vermes a 20 °C, como descrito anteriormente8. Sincronizar vermes realizando um ovo cronometrado coloca52 e estuda v…

Representative Results

A análise da atividade locomotor de C. elegans na mídia líquida poderia facilmente capturar um fenótipo integrado de modelos de vermes de doença mitocondrial que podem não ser facilmente quantificáveis em mídia sólida. O ZebraLab foi usado para quantificar a atividade locomotor do complexo mitocondrial bem estabelecido I doença gas-1(fc21) cepa relativa aos WTworms em mídia líquida no estágio larval L4. A atividade de 5 vermes em uma única gota líquida foi registrada ao longo de …

Discussion

Aqui, o estudo resumiu informações detalhadas e razões para o estudo da atividade neuromuscular C. elegans ao nível de desfechos diversos, incluindo espancamento de vermes, locomoção, bombeamento faríndico e quimitaxis. A comparação de 16 diferentes metodologias de análise de atividade foi realizada em termos de rendimento relativo, vantagens e limitações de atividades de nematoide quantificadas em populações de vermes ou vermes em diferentes idades e durações experimentais. Entre elas, duas nova…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos a Anthony Rosner, PhD., com seu apoio organizacional para a preparação antecipada deste projeto, e a Erin Haus por contribuir para a análise do protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Juliet’s Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, o Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund e os Institutos Nacionais de Saúde (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 e T32-NS007413). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos financiadores ou dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materials

C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis
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Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).
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