Vi har utvecklat ett enkelt och billigt protokoll för att ladda Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteinkomplex inom virusliknande partiklar. Dessa partiklar, som kallas “Nanoblades”, möjliggör effektiv leverans av Cas9/sgRNA-komplexet i odödliga och primära celler samt in vivo.
Det grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska repetitionerna (CRISPR)-Cas-systemet har demokratiserat genomredigering i eukaryota celler och lett till utvecklingen av många innovativa applikationer. Leverans av Cas9-proteinet och enkelstyrnings-RNA (sgRNA) till målceller kan dock vara tekniskt utmanande. Klassiska virala vektorer, såsom de som härrör från lentivirus (LVs) eller adeno-associerade virus (AAV), möjliggör effektiv leverans av transgenes kodning för Cas9 proteinet och dess associerade sgRNA i många primära celler och in vivo. Ändå kan dessa vektorer drabbas av nackdelar som integration av transgenet i målcellsgenomet, en begränsad lastkapacitet och ett långsiktigt uttryck för Cas9-proteinet och vägleda RNA i målceller.
För att övervinna några av dessa problem utvecklades en leveransvektor baserad på murin leukemiviruset (MLV) för att paketera Cas9-proteinet och dess tillhörande guide RNA i avsaknad av kodande transgen. Genom att smälta Cas9-proteinet till C-ändstationen av det strukturella proteinet Gag från MLV bildades virusliknande partiklar (VLPs) laddade med Cas9-proteinet och sgRNA (med namnet “Nanoblades). Nanoblad kan samlas in från odlingsmediet av producentceller, renas, kvantifieras och användas för att omvandla målceller och leverera det aktiva Cas9/sgRNA-komplexet. Nanoblad levererar sin ribonukleproteinlast (RNP) övergående och snabbt i ett brett spektrum av primära och odödliga celler och kan programmeras för andra tillämpningar, såsom övergående transkriptionell aktivering av riktade gener, med hjälp av modifierade Cas9-proteiner. Nanoblad kan in vivo genomredigering i levern hos injicerade vuxna möss och i äggceller för att generera transgena djur. Slutligen kan de komplexeras med donator-DNA för “transfektfri” homologistyrd reparation. Nanoblade preparat är enkelt, relativt billigt, och kan enkelt utföras i alla cellbiologiska laboratorier.
Jämfört med andra programmerbara nukleaser förenklade crispr-cas-systemet dramatiskt och demokratiserade förfarandet för sekvensspecifik genominriktning och klyvning i eukaryota celler. Genom det enkla uttrycket av ett sgRNA kan användare programmera Cas9-proteinet (eller optimerade varianter) för nästan alla cellulära locus1. I detta scenario blir leverans av Cas9-proteinet och sgRNA den största begränsningen när man utför platsstyrd mutagenes. I odödliga celler kan sgRNA och Cas-proteinet enkelt uttryckas från transfected plasmider för att uppnå effektiv genominriktning i de flesta celler. Konstituerande uttryck av Cas9/sgRNA-komplexet kan dock öka cas9-proteinets off-target-aktivitet och införa oönskade förändringar i icke-specifika lokus2. I primärceller kan DNA-transfektion vara tekniskt svår att uppnå och leda till dåligt uttryck eller en liten andel transfekterade celler. Alternativ till klassisk DNA-transfektion omfattar användning av virusvektorer som levererar en transgenekodning för Cas9 och sgRNA eller elektroporation av rekombinant Cas9-protein kopplat till ett syntetiskt sgRNA. Dessa metoder kan dock leda till transgene integration inom cellen värd genom (som är fallet för klassiska retrovirala och lentiviral uttryck vektorer), begränsning av cellulära faktorer och leda till konstituerande uttryck av Cas9 protein och sgRNA.
Elektroporation av Cas9/sgRNA RNP-komplexet kan övervinna de flesta av dessa problem och leda till effektiv och övergående leverans i primärceller och in vivo samt möjliggöra ett dosberoende svar. Ändå förlitar det sig vanligtvis på dyr utrustning och reagenser och är också svårt att skala upp om ett stort antal celler måste behandlas. Som ett alternativ till de ovan nämnda teknikerna har dessa författare utvecklat “Nanoblades”-en retroviral leveransvektor för Cas9-proteinet och sgRNA3 som är konceptuellt lik andra viralt härledda kapsidproteinleveranssystem4,5,6,7,8. Nanoblad utnyttjar den naturliga kapaciteten hos Gag polyprotein från retrovirus för att producera, när de uttrycks ensam i odlade celler, VLPs som frigörs i det extracellulära medium9. Genom att smälta Cas9-proteinet till C-terminaländen av murinleukemiviruset (MLV) Gag polyprotein och co-expressing sgRNA och virala kuvert glykoproteiner, Cas9 proteinet kan kapslas in i släppta VLPs eller Nanoblades. Vid rening kan Nanoblades inkuberas med målceller eller injiceras in vivo för att förmedla snabb, övergående och dosberoende leverans av Cas9/sgRNA RNP-komplexet3.
Nanoblad kan programmeras med flera sgRNAs för samtidig redigering vid olika lokus eller med Cas9-varianter för att utföra andra applikationer som målspecifik transkriptionsaktivering eller repression3. I motsats till proteinelektroporation, som förlitar sig på rekombinant uttryck, kan nyligen beskrivna Cas-varianter från litteraturen enkelt klonas till Gag fusion-uttrycksvektorn, vilket gör den till en mångsidig plattform. Nanoblad kan ytterligare komplexeras eller laddas med enkelsträngade och dubbelsträngade olideoxynucleotides (ssODNs) för att utföra homologistyrd reparation3. Nanobladeproduktionen är relativt enkel och billig. Dessutom kan Nanoblades förvaras vid 4 °C i många dagar eller vid -80 °C för långtidslagring. Vanligtvis förmedlar Nanoblades effektiv, transgenefri genomredigering i de flesta odödliga och primära odlade celler. Vissa primärceller kan dock vara känsliga för förekomst av viruspartiklar, vilket resulterar i ökad dödlighet. Celler i det medfödda immunsystemet kan också reagera på närvaron av Nanoblades (på grund av deras virala ursprung) och aktiveras. I dessa fall måste transduktionsprotokollet optimeras för att begränsa exponeringstiden för Nanoblades och minimera ospecificerade effekter. Nanoblades representerar ett livskraftigt och lättimpant alternativ till andra tillgängliga CRISPR-leveransmetoder.
Nanoblad möjliggör snabb och dosberoende leverans av Cas9/sgRNA RNP-komplexet i cellinjer och primärceller. I motsats till klassisk transfektion och andra virala leveransvektorer, men liksom proteinelektroporation, nanoblades har fördelen av övergående leverans av Cas9/sgRNA RNP på ett transgene-fritt sätt. Nanoblades erbjuder en mycket mångsidig, enkel och billig plattform för proteinleverans som enkelt och snabbt kan anpassas till den ständigt växande familjen av CRISPR-varianter. Nanoblad kan produceras i HEK293T-cellinjen eller dess derivat. HEK293T-cellinjer som används här har utvecklats för att maximera retroviral och lentiviral partikelproduktion (se tabellen över material). Även om andra källor till HEK293T-celler kan vara lämpliga, måste användarna dock testa och jämföra HEK293T-celler från olika källor eftersom stora skillnader i partikelproduktion har observerats beroende på HEK293T-cellkällan. Celler måste också kontrolleras för Mycoplasma kontaminering ofta och passages var tredje dag (klassiskt 1/8 utspädning) för att undvika överkonfluens, vilket har en negativ inverkan på partikelproduktionen.
Celler bör inte underhållas i över 20 passager. DMEM kompletteras med glukos, penicillin/streptomycin, glutamin och 10% decomplemented fetala nötkreatur serum användes för cellodling. Eftersom serumursprung kan påverka nanobladpreparatets kvalitet bör olika serumpartier testas före storskalig produktion. Nanoblad kan effektivt produceras i andra medier som RPMI eller serumfria modifieringar av minsta väsentliga medium som kan ersätta DMEM dagen efter transfektion. Som anges nedan, även om medium ersättning efter transfektion med vissa DNA-transfektering reagenser är valfritt, kan det vara fördelaktigt att ändra det medium i vilket VLPs släpps ut, särskilt för att begränsa serumspår i partikelpreparatet. Odling av celler i reducerat serum minimum väsentligt medium dagen före transfection har dock ännu inte försökts.
Som nämnts produceras Nanoblades vid överuttryck av en blandning av plasmider i producentceller. Överuttryck verkar krävas för optimal produktion. Detta laboratorium utvecklade faktiskt en producentcelllinje där Gag-Pol-uttryckskonstruktionen stabiliserades genom antibiotikaval. Detta system kunde dock inte producera betydande mängder nanoblad. En liknande observation gjordes när sgRNA-kodningskonstruktionen var stabilt integrerad i arvsmassan hos producentceller. Som beskrivs för andra partikelproduktionssystem kan en stabil cellinje som uttrycker åtminstone vissa konstruktioner som är involverade i Nanoblades produktion vara användbar. Detta skulle dock säkert kräva bearbetning av stora volymer supernatant och en lämplig teknik för att rena partiklar. I ovanstående protokoll beskrivs det förfarande som föredras för att producera nanoblad som utnyttjar specifika reagenser för transfekt (se materialförteckningen).
Även om transfektreagenser från andra tillverkare också har testats med framgång, följer de allra flesta av denna grupps resultat med Nanoblades proceduren som beskrivs häri. Lågkostnadstransfektering kan uppnås med hjälp av kalciumfosfatreagenser och ge god produktionseffektivitet. Denna metod kräver dock absolut utbyte av transfekteringsmedium dagen efter transfektion och kan lämna kalciumfosfatrester i sedimenterat partikelpreparat. I överensstämmelse med behovet av höga uttrycksnivåer för Nanoblade-komponenter i producentceller är observationen att mängden sgRNAs associerade med Cas9-proteinet kan vara en begränsande faktor för effektiv genomredigering. För att förbättra sgRNA-lastning har två tekniska metoder nyligen utvecklats av oberoende grupper som använder proteinleveransvektorer som liknar Nanoblades. Dessa förlitar sig på användning av T7 polymerasberoende cytoplasmiskt uttryck av sgRNA6 eller genom tillsats av en retroviral inkapslingssignal till sgRNA-sekvensen för att medla bindning till Gag polyprotein6. Dessa metoder kan verkligen förbättra sgRNA-belastningen inom Nanoblades även om de inte har testats ännu.
Transduktion av målceller är ett kritiskt steg i förfarandet. I de flesta odödliga cellinjer har transduktion med Nanoblades liten eller ingen cytopatisk effekt. Men i primärceller kan toxicitet vara ett problem. Transduktionen måste därför optimeras för varje celltyp. Specifikt är exponeringstiden för Nanoblades en viktig faktor att ändra när flyttningsprotokollet optimeras. För känsliga celler som primära nervceller eller benmärgsceller möjliggör 4-6 h inkubation med Nanoblades innan du byter ut mediet effektiv leverans av Cas9-proteinet samtidigt som celltoxiciteten minimeras. Dessutom kan adjuvanser som bland annat katjonpolymerer avsevärt förbättra effektiviteten av transduktion i vissa celler (se materialförteckningen). Det är viktigt att notera att Nanoblades är VLPs och kan inducera ett immunogenic svar. Detta kan vara en begränsning om arbete med vissa typer av primärceller, såsom makrofager eller dendritiska celler, där inkubation med Nanoblades kan inducera viktiga förändringar i genuttryck och cellernas fenotyp. Om makrofager och dendritiska celler härrör från hematopoetiska stamcellsprekursorer (såsom musbensceller), är det att föredra att omföra celler med Nanoblades innan de är helt differentierade för att undvika att inducera ett cellulärt svar mot Nanoblades. Annars kan Cas9 proteinelektroporation utgöra ett genomförbart alternativ när man arbetar med differentierade immunceller.
Nanoblad kan användas in vivo för att omvandla muszygoter eller embryon för att generera transgena djur. I likhet med klassiska retrovirala eller lentivirala vektorer kan de också injiceras direkt i vävnader från vuxna djur. Nanoblad (som liknar retrovirala och lentivirala vektorer) kan dock inaktiveras av värddjurets immunsvar. Därför måste dosen som ska injiceras optimeras för varje applikation. Detta immunsvar kan också begränsa fördelningen av funktionella VLPs till vävnader nära injektionsstället. Slutligen, till skillnad från lentiviral vektorer, nanoblades är transgene-fria och levererar Cas9 inom en begränsad tidsram. Därför kan de inte användas för att utföra genomomfattande funktionella screenings som kräver hög genomströmning sekvensering av sgRNAs vid val av celler. Nanoblad är användbara när snabb, dosberoende och transgenefri genomredigering krävs20. I likhet med proteinelektroporation leder Nanoblades dessutom till färre off-target effekter än långvarigt uttryck av Cas9/sgRNA genom DNA-transfektion eller klassiska virusvektorer3. Framtida utveckling av Nanoblades är inriktad på att införliva Cas9-varianter för olika tekniska applikationer som basredigering och RNA-inriktning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) vid Université de Lyon, inom programmet Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007) som drivs av den franska nationella forskningsbyrån (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) och europeiska forskningsrådet (ERC-StG-LS6-805500 till E.P.R.) under Europeiska unionens forskningsprogram.
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |