Мы описываем модель метастазов рака молочной железы с помощью ксенотрансплантата мыши, полученную путем инъекции в хвостовую вену эндогенной HER2-усиленной воспалительной клеточной линии рака молочной железы.
Метастатическое распространение в головной мозг является распространенным и разрушительным проявлением многих видов рака. Только в Соединенных Штатах ежегодно у 200 000 пациентов диагностируются метастазы в головном мозге. Значительный прогресс был достигнут в улучшении показателей выживаемости пациентов с первичным раком молочной железы и системными злокачественными новообразованиями; Тем не менее, неутешительный прогноз для пациентов с клиническими метастазами в головной мозг подчеркивает настоятельную необходимость разработки новых терапевтических средств и стратегий против этого смертельного заболевания. Отсутствие подходящих экспериментальных моделей было одним из основных препятствий, препятствующих прогрессу в понимании биологии и лечения метастазов в мозге. В данной статье мы описываем мышиную модель метастазирования в головной мозг с помощью ксенотрансплантата с помощью инъекции в хвостовую вену эндогенной HER2-амплифицированной клеточной линии, полученной из воспалительного рака молочной железы (IBC), редкой и агрессивной формы рака молочной железы. Клетки были помечены люциферазой светлячков и зеленым флуоресцентным белком для мониторинга метастазов в мозг и количественно оценивали метастатическую нагрузку с помощью биолюминесцентной визуализации, флуоресцентной стереомикроскопии и гистологической оценки. У мышей устойчиво и последовательно развиваются метастазы в головном мозге, что позволяет исследовать ключевые медиаторы метастатического процесса и разрабатывать доклинические испытания новых стратегий лечения.
Метастазы в головной мозг являются распространенным и смертельно опасным осложнением системных злокачественных новообразований. Большинство метастазов в головном мозге происходит из первичных опухолей легких, молочной железы или кожи, которые в совокупности составляют 67-80% случаев 1,2. Оценки частоты метастазирования в головной мозг варьируются от 100 000 до 240 000 случаев, и эти цифры могут быть заниженными, поскольку аутопсия редко проводится для пациентов, умерших от метастатическогорака. Пациенты с метастазами в головной мозг имеют худший прогноз и более низкую общую выживаемость по сравнению с пациентами без метастазов в головном мозге4. Современные варианты лечения метастазов в головном мозге в значительной степени паллиативны и не улучшают показатели выживаемости большинства пациентов5. Таким образом, метастазирование в головной мозг остается проблемой, и необходимость лучшего понимания механизмов прогрессирования метастазов в головном мозге для разработки более эффективных методов лечения остается настоятельной.
Использование экспериментальных моделей дало важные сведения о специфических механизмах метастатической прогрессии рака молочной железы в головной мозг и позволило оценить эффективность различных терапевтических подходов 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Тем не менее, очень немногие модели могут точно и полно повторить тонкости развития метастазов в головном мозге. Несколько экспериментальных моделей in vivo были получены путем инокуляции раковых клеток мышам различными путями введения, включая ортотопические, внутривенные, интракардичные, внутрисонные артериальные и внутримозговые инъекции. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, как описано в другом месте3. Однако ни одна из этих мышиных моделей не может полностью воспроизвести клиническое прогрессирование метастазов в головном мозге.
Метастазы в головном мозге особенно распространены у пациенток с воспалительным раком молочной железы (МКБ), редким, но агрессивным вариантом первичного рака молочной железы. На IBC приходится от 1% до 4% случаев рака молочной железы, но на него приходится непропорционально много смертей, связанных с раком молочной железы, в Соединенных Штатах17,18. Известно, что IBC быстро метастазирует; действительно, треть пациентов с МКБ имеют отдаленные метастазы на момент постановки диагноза19,20. Что касается метастазов в головной мозг, пациенты с МКБ имеют более высокую частоту метастазирования в головной мозг, чем пациенты с не-МКБ21. Недавно мы продемонстрировали, что клеточная линия MDA-IBC3, полученная из злокачественной плевральной выпотной жидкости пациента с ER-/PR-/HER2+ IBC, которая повторяет характеристики IBC в мышиных ксенотрансплантатах, имеет повышенную склонность к развитию метастазов в головном мозге, а не в легких у мышей при введении через хвостовую вену, что делает эту клеточную линию хорошей моделью для изучения развития метастазов в мозг16.
В данной статье мы опишем процедуры генерации метастазов в головной мозг с помощью инъекции клеток MDA-IBC3 в хвостовую вену, а также для оценки метастатической нагрузки с помощью стереофлуоресцентной микроскопии и визуализации люциферазы. Этот метод был использован для обнаружения ключевых медиаторов метастазирования рака молочной железы в головной мозг и для проверки эффективности терапевтических вмешательств 16,22,23. Недостатком этой методики является то, что она не повторяет все этапы метастатического процесса в головном мозге. Тем не менее, его основные преимущества включают в себя надежность и воспроизводимость, вовлечение соответствующей биологии метастазирования при интравазации, прохождении через легкие и экстравазации в мозг, а также относительную простоту с точки зрения техники.
Протокол включает в себя несколько критически важных шагов. Клетки следует держать на льду не дольше 1 часа для сохранения жизнеспособности. Для протирания хвостов мышей перед инъекцией следует использовать спиртовые ватные диски, при этом следует следить за тем, чтобы не протирать сл?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Кристин Ф. Воган (Christine F. Wogan), MS, ELS, из отделения радиационной онкологии MD Anderson за научное редактирование рукописи, и Кэрол М. Джонстон (Carol M. Johnston) из Отделения хирургии гистологического центра MD Anderson за помощь в окрашивании гематоксилином и эозином. Мы благодарны Центру ветеринарной медицины и хирургии MD Anderson за их поддержку исследований на животных. Эта работа была поддержана следующими грантами: Грант Сьюзан Г. Комен (Susan G. Komen Career Catalyst Research Research) (CCR16377813 для BGD), грант Американского онкологического общества (RSG-19-126-01 для BGD) и Программа штата Техас по исследованию редкого и агрессивного рака молочной железы. Также частично поддерживается грантом P30 Cancer Center Support (Core) CA016672 от Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения до Онкологического центра им. М. Д. Андерсона Техасского университета.
Cell Culture | |||
1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
Tail vein injection | |||
C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
Imaging | |||
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
Stereomicroscope Imaging | |||
Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |