Vi beskriver en xenograft musemodel af brystkræfthjernemetastaser genereret via haleveneinjektion af en endogen HER2-amplificeret inflammatorisk brystkræftcellelinje.
Metastatisk spredning til hjernen er en almindelig og ødelæggende manifestation af mange typer kræft. I USA alene diagnosticeres omkring 200.000 patienter med hjernemetastaser hvert år. Der er gjort betydelige fremskridt med at forbedre overlevelsesresultaterne for patienter med primær brystkræft og systemiske maligniteter. Den dystre prognose for patienter med kliniske hjernemetastaser understreger imidlertid det presserende behov for at udvikle nye terapeutiske midler og strategier mod denne dødelige sygdom. Manglen på egnede eksperimentelle modeller har været en af de største forhindringer for fremskridt i vores forståelse af hjernens metastasebiologi og behandling. Heri beskriver vi en xenograft musemodel af hjernemetastase genereret via haleveneinjektion af en endogen HER2-amplificeret cellelinje afledt af inflammatorisk brystkræft (IBC), en sjælden og aggressiv form for brystkræft. Celler blev mærket med firefly luciferase og grønt fluorescensprotein for at overvåge hjernemetastaser og kvantificeret metastatisk byrde ved bioluminescensbilleddannelse, fluorescerende stereomikroskopi og histologisk evaluering. Mus udvikler robust og konsekvent hjernemetastaser, hvilket muliggør undersøgelse af nøglemediatorer i den metastatiske proces og udvikling af præklinisk test af nye behandlingsstrategier.
Hjernemetastase er en almindelig og dødelig komplikation af systemiske maligniteter. De fleste hjernemetastaser stammer fra primære tumorer i lunger, bryst eller hud, som tilsammen tegner sig for 67-80% af tilfældene 1,2. Estimater af forekomsten af hjernemetastaser varierer mellem 100.000 og 240.000 tilfælde, og disse tal kan undervurderes, fordi obduktion er sjælden for patienter, der døde af metastatisk kræft3. Patienter med hjernemetastaser har en dårligere prognose og lavere samlet overlevelse i forhold til patienter uden hjernemetastaser4. Nuværende behandlingsmuligheder for hjernemetastaser er stort set palliative og forbedrer ikke overlevelsesresultaterne for de fleste patienter5. Således forbliver hjernemetastase en udfordring, og behovet er fortsat presserende for bedre at forstå mekanismerne for hjernemetastaseprogression for at udvikle mere effektive terapier.
Brugen af eksperimentelle modeller har givet vigtig indsigt i specifikke mekanismer for brystkræftmetastatisk progression til hjernen og tilladt evaluering af effektiviteten af forskellige terapeutiske tilgange 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Imidlertid kan meget få modeller nøjagtigt og fuldt ud rekapitulere forviklingerne ved hjernens metastaseudvikling. Flere eksperimentelle in vivo-modeller er blevet genereret via podning af kræftceller i mus ved forskellige administrationsveje, herunder ortotopiske, halevene, intrakardie, intracarotidarteriele og intracerebrale injektioner. Hver teknik har fordele og ulemper, som gennemgået andetsteds3. Ingen af disse musemodeller kan imidlertid fuldt ud replikere den kliniske progression af hjernemetastaser.
Hjernemetastaser er særligt almindelige hos patienter med inflammatorisk brystkræft (IBC), en sjælden, men aggressiv variant af primær brystkræft. IBC tegner sig for 1% til 4% af brystkræfttilfældene, men det er ansvarligt for uforholdsmæssigt 10% af brystkræftrelaterede dødsfald i USA17,18. IBC er kendt for hurtigt at metastasere; faktisk har en tredjedel af IBC-patienterne fjern metastase på diagnosetidspunktet19,20. Specifikt for hjernemetastaser har patienter med IBC en højere forekomst af hjernemetastaser end patienter med ikke-IBC21. For nylig demonstrerede vi, at MDA-IBC3-cellelinjen, der stammer fra den ondartede pleurale effusionsvæske hos en patient med ER–/PR-/HER2+ IBC, der rekapitulerer IBC-egenskaber hos musexenotransplantater, har en øget tilbøjelighed til at udvikle hjernemetastaser snarere end lungemetastaser hos mus, når de injiceres af halevenen, hvilket gør denne cellelinje til en god model til at studere udviklingen af hjernemetastaser16.
Heri beskriver vi procedurerne for at generere hjernemetastase via haleveneinjektion af MDA-IBC3-celler og for at evaluere den metastatiske byrde via stereofluorescerende mikroskopi og luciferasebilleddannelse. Denne metode er blevet brugt til at opdage nøglemediatorer af brystkræftmetastaser til hjernen og til at teste effekten af terapeutiske indgreb 16,22,23. Ulempen ved denne teknik er, at den ikke rekapitulerer alle trin i hjernens metastatiske proces. Ikke desto mindre omfatter dens største fordele robusthed og reproducerbarhed, involvering af den relevante metastasebiologi ved intravasation, krydsning af lungerne og ekstravasation i hjernen og dens relative enkelhed med hensyn til teknik.
Protokollen indeholder flere kritiske trin. Celler bør opbevares på is i højst 1 time for at opretholde levedygtigheden. Alkoholiske vatrondeller bør bruges til at tørre musenes haler før injektion, idet man skal passe på ikke at tørre for hårdt eller for ofte for at undgå at beskadige halehuden. Sørg for, at der ikke er luftbobler til stede i cellesuspensionen for at forhindre mus i at dø af blodkaremboli. Hold injektionsvinklen på 45° eller mindre for at undgå at gennembore blodkarret i halerne, og stik …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christine F. Wogan, MS, ELS, fra MD Anderson’s Division of Radiation Oncology for videnskabelig redigering af manuskriptet og Carol M. Johnston fra MD Anderson’s Division of Surgery Histology Core for hjælp med hæmatoxylin og eosinfarvning. Vi er taknemmelige over for Veterinary Medicine and Surgery Core hos MD Anderson for deres støtte til dyreforsøgene. Dette arbejde blev støttet af følgende bevillinger: Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 til BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19–126–01 til BGD) og State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Også delvist støttet af Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, til University of Texas MD Anderson Cancer Center.
Cell Culture | |||
1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
Tail vein injection | |||
C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
Imaging | |||
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
Stereomicroscope Imaging | |||
Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |