Modellering af hjernemetastase via haleveneinjektion af inflammatoriske brystkræftceller
Summary
Vi beskriver en xenograft musemodel af brystkræfthjernemetastaser genereret via haleveneinjektion af en endogen HER2-amplificeret inflammatorisk brystkræftcellelinje.
Abstract
Metastatisk spredning til hjernen er en almindelig og ødelæggende manifestation af mange typer kræft. I USA alene diagnosticeres omkring 200.000 patienter med hjernemetastaser hvert år. Der er gjort betydelige fremskridt med at forbedre overlevelsesresultaterne for patienter med primær brystkræft og systemiske maligniteter. Den dystre prognose for patienter med kliniske hjernemetastaser understreger imidlertid det presserende behov for at udvikle nye terapeutiske midler og strategier mod denne dødelige sygdom. Manglen på egnede eksperimentelle modeller har været en af de største forhindringer for fremskridt i vores forståelse af hjernens metastasebiologi og behandling. Heri beskriver vi en xenograft musemodel af hjernemetastase genereret via haleveneinjektion af en endogen HER2-amplificeret cellelinje afledt af inflammatorisk brystkræft (IBC), en sjælden og aggressiv form for brystkræft. Celler blev mærket med firefly luciferase og grønt fluorescensprotein for at overvåge hjernemetastaser og kvantificeret metastatisk byrde ved bioluminescensbilleddannelse, fluorescerende stereomikroskopi og histologisk evaluering. Mus udvikler robust og konsekvent hjernemetastaser, hvilket muliggør undersøgelse af nøglemediatorer i den metastatiske proces og udvikling af præklinisk test af nye behandlingsstrategier.
Introduction
Hjernemetastase er en almindelig og dødelig komplikation af systemiske maligniteter. De fleste hjernemetastaser stammer fra primære tumorer i lunger, bryst eller hud, som tilsammen tegner sig for 67-80% af tilfældene 1,2. Estimater af forekomsten af hjernemetastaser varierer mellem 100.000 og 240.000 tilfælde, og disse tal kan undervurderes, fordi obduktion er sjælden for patienter, der døde af metastatisk kræft3. Patienter med hjernemetastaser har en dårligere prognose og lavere samlet overlevelse i forhold til patienter uden hjernemetastaser4. Nuværende behandlingsmuligheder for hjernemetastaser er stort set palliative og forbedrer ikke overlevelsesresultaterne for de fleste patienter5. Således forbliver hjernemetastase en udfordring, og behovet er fortsat presserende for bedre at forstå mekanismerne for hjernemetastaseprogression for at udvikle mere effektive terapier.
Brugen af eksperimentelle modeller har givet vigtig indsigt i specifikke mekanismer for brystkræftmetastatisk progression til hjernen og tilladt evaluering af effektiviteten af forskellige terapeutiske tilgange 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Imidlertid kan meget få modeller nøjagtigt og fuldt ud rekapitulere forviklingerne ved hjernens metastaseudvikling. Flere eksperimentelle in vivo-modeller er blevet genereret via podning af kræftceller i mus ved forskellige administrationsveje, herunder ortotopiske, halevene, intrakardie, intracarotidarteriele og intracerebrale injektioner. Hver teknik har fordele og ulemper, som gennemgået andetsteds3. Ingen af disse musemodeller kan imidlertid fuldt ud replikere den kliniske progression af hjernemetastaser.
Hjernemetastaser er særligt almindelige hos patienter med inflammatorisk brystkræft (IBC), en sjælden, men aggressiv variant af primær brystkræft. IBC tegner sig for 1% til 4% af brystkræfttilfældene, men det er ansvarligt for uforholdsmæssigt 10% af brystkræftrelaterede dødsfald i USA17,18. IBC er kendt for hurtigt at metastasere; faktisk har en tredjedel af IBC-patienterne fjern metastase på diagnosetidspunktet19,20. Specifikt for hjernemetastaser har patienter med IBC en højere forekomst af hjernemetastaser end patienter med ikke-IBC21. For nylig demonstrerede vi, at MDA-IBC3-cellelinjen, der stammer fra den ondartede pleurale effusionsvæske hos en patient med ER–/PR-/HER2+ IBC, der rekapitulerer IBC-egenskaber hos musexenotransplantater, har en øget tilbøjelighed til at udvikle hjernemetastaser snarere end lungemetastaser hos mus, når de injiceres af halevenen, hvilket gør denne cellelinje til en god model til at studere udviklingen af hjernemetastaser16.
Heri beskriver vi procedurerne for at generere hjernemetastase via haleveneinjektion af MDA-IBC3-celler og for at evaluere den metastatiske byrde via stereofluorescerende mikroskopi og luciferasebilleddannelse. Denne metode er blevet brugt til at opdage nøglemediatorer af brystkræftmetastaser til hjernen og til at teste effekten af terapeutiske indgreb 16,22,23. Ulempen ved denne teknik er, at den ikke rekapitulerer alle trin i hjernens metastatiske proces. Ikke desto mindre omfatter dens største fordele robusthed og reproducerbarhed, involvering af den relevante metastasebiologi ved intravasation, krydsning af lungerne og ekstravasation i hjernen og dens relative enkelhed med hensyn til teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen indeholder flere kritiske trin. Celler bør opbevares på is i højst 1 time for at opretholde levedygtigheden. Alkoholiske vatrondeller bør bruges til at tørre musenes haler før injektion, idet man skal passe på ikke at tørre for hårdt eller for ofte for at undgå at beskadige halehuden. Sørg for, at der ikke er luftbobler til stede i cellesuspensionen for at forhindre mus i at dø af blodkaremboli. Hold injektionsvinklen på 45° eller mindre for at undgå at gennembore blodkarret i halerne, og stik …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Christine F. Wogan, MS, ELS, fra MD Anderson’s Division of Radiation Oncology for videnskabelig redigering af manuskriptet og Carol M. Johnston fra MD Anderson’s Division of Surgery Histology Core for hjælp med hæmatoxylin og eosinfarvning. Vi er taknemmelige over for Veterinary Medicine and Surgery Core hos MD Anderson for deres støtte til dyreforsøgene. Dette arbejde blev støttet af følgende bevillinger: Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 til BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19–126–01 til BGD) og State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Også delvist støttet af Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, til University of Texas MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
- Achrol, A. S., et al. Brain metastases. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 5 (2019).
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Report. 14 (1), 48-54 (2012).
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al. The evolving landscape of brain metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Research. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer – A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Cancer Research. 80 (4), 10 (2020).
