De gepresenteerde protocollen kunnen worden gebruikt om de respons van fluorescerend gelabelde microbubbels te karakteriseren die zijn ontworpen voor toepassingen met echografie-geactiveerde medicijnafgifte, inclusief hun activeringsmechanismen en hun bio-effecten. Dit artikel behandelt een reeks in vitro en in vivo microscopietechnieken die worden uitgevoerd om de relevante lengte en tijdschalen vast te leggen.
Microbubbelcontrastmiddelen zijn veelbelovend voor medicijnafgiftetoepassingen met echografie. Het inkapselen van geneesmiddelen in nanodeeltjes vermindert de systemische toxiciteit en verhoogt de circulatietijd van de geneesmiddelen. In een nieuwe benadering van microbubbel-geassisteerde medicijnafgifte worden nanodeeltjes opgenomen in of op microbubbelschalen, waardoor lokale en geactiveerde afgifte van de nanodeeltjeslading met echografie mogelijk is. Een grondig begrip van de afgiftemechanismen binnen de enorme ultrasone parameterruimte is cruciaal voor een efficiënte en gecontroleerde afgifte. Deze set gepresenteerde protocollen is van toepassing op microbubbels met een schaal met een fluorescerend label. Hier ligt de focus op microbubbels geladen met poly (2-ethyl-butylcyanoacrylaat) polymere nanodeeltjes, gedopeerd met een gemodificeerde Nijlrode kleurstof. De deeltjes worden gefixeerd in een gedenatureerde caseïneschil. De microbubbels worden geproduceerd door krachtig roeren, waardoor een dispersie van perfluorpropaangas in de vloeibare fase wordt gevormd die caseïne en nanodeeltjes bevat, waarna de microbubbelschaal zichzelf assembleert. Een verscheidenheid aan microscopietechnieken zijn nodig om de nanodeeltjesgestabiliseerde microbubbels te karakteriseren op alle relevante tijdschalen van het nanodeeltjesafgifteproces. Fluorescentie van de nanodeeltjes maakt confocale beeldvorming van enkele microbubbels mogelijk, waardoor de deeltjesverdeling in de schaal wordt onthuld. In vitro ultrasnelle beeldvorming met behulp van bright-field microscopie met 10 miljoen frames per seconde geeft inzicht in de beldynamiek in reactie op ultrasone insonatie. Ten slotte kan het vrijkomen van nanodeeltjes uit de bellenschil het best worden gevisualiseerd door middel van fluorescentiemicroscopie, uitgevoerd met 500.000 frames per seconde. Om de toediening van geneesmiddelen in vivo te karakteriseren, wordt de geactiveerde afgifte van nanodeeltjes in de vasculatuur en hun extravasatie buiten de endotheellaag bestudeerd met behulp van intravitale microscopie in tumoren die zijn geïmplanteerd in dorsale huidplooivensterkamers, over een tijdschaal van enkele minuten. De combinatie van deze complementaire karakteriseringstechnieken biedt uniek inzicht in het gedrag van microbubbels en hun payload-afgifte op een reeks tijd- en lengteschalen, zowel in vitro als in vivo.
Echografie is de meest gebruikte medische beeldvormingstechniek. Het is niet-invasief, snel, veilig, kosteneffectief en draagbaar1,2,3. Bloed is echter een slechte ultrasone verstrooier en het contrast van de bloedpool kan worden versterkt door een intraveneuze injectie van ultrasone contrastmiddelen3. Dit verbeterde bloedpoolcontrast maakt de kwantificering van orgaanperfusie voor diagnostische doeleinden mogelijk, bijvoorbeeld bij de detectie van coronaire hartziekte4 en gemetastaseerde leverziekte5. Inderdaad, tumor vasculatuur bleek een belangrijke prognostische factor te zijn6. Een grote onderzoeksinspanning is nu gericht op microbubbel-geassisteerde, gerichte moleculaire beeldvorming en het op maat maken van contrastmiddelen voor therapeutisch gebruik.
In de handel verkrijgbare ultrasone contrastmiddelen bestaan meestal uit een suspensie van gecoate microbubbels7,8 met diameters variërend van 1 μm tot 10 μm9. Omdat microbubbels van ultrasoon contrastmiddel iets kleiner zijn dan rode bloedcellen7, kunnen de microbubbels zelfs de kleinste haarvaten veilig bereiken zonder een occlusie te creëren3. Microbubbels hebben een dramatisch verhoogde ultrasone backscatteringscoëfficiënt in vergelijking met weefsel10, vanwege hun samendrukbare gaskern11. Bovendien is de microbubbelecho zeer niet-lineair, d.w.z. het spectrum bevat harmonischen en subharmonieën van de aandrijffrequentie. Daarnaast is de echosterkte sterk afhankelijk van de resonantierespons van de bubble12. Hoewel weefsel slechts lineair verstrooit, is een klein aantal microbubbels voldoende om een hoge detectiegevoeligheid te bereiken in harmonische beeldvorming13,14. Deze niet-lineaire contrastgeneratie kan zelfs sterk genoeg zijn om enkele bellen in het lichaam te volgen15.
De schil van het ultrasone contrastmiddel stabiliseert de bellen tegen ontbinding en coalescentie, waardoor hun circulatietijd in de bloedpool toeneemt16. De schil kan bestaan uit lipiden, polymeren of gedenatureerde eiwitten3,8. Het vermindert de interfaciale spanning, waardoor het effect van Laplace drukgestuurde oplossing17 wordt beperkt en een resistieve barrière tegen gasdiffusie wordt gecreëerd18. Om de stabiliteit verder te verhogen, worden de contrastmicrobubbels meestal gevuld met een gas met een hoog molecuulgewicht en een lage oplosbaarheid in bloed11. De microbubbelschaal verandert de reactie van de microbubbels op ultrasone insonatie drastisch11. Ongecoate gasbellen hebben een karakteristieke resonantiefrequentie die omgekeerd evenredig is met hun grootte en de toevoeging van een lipidecoating verhoogt de resonantiefrequentie ten opzichte van die van een ongecoate buble vanwege de intrinsieke stijfheid van de schaal3. Bovendien dissipeert de schaal energie door dilatatieviscositeit, die de dominante bron van demping vormt voor gecoate bellen3. De stabiliserende schaal heeft als bijkomend voordeel dat deze kan worden gefunctionaliseerd, bijvoorbeeld door gerichte liganden aan het oppervlak van microbubbels te binden. Deze targeting maakt vele toepassingen voor deze bubbels mogelijk en in het bijzonder moleculaire beeldvorming met echografie14,19.
Microbubbelcontrastmiddelen zijn veelbelovend voor medicijnafgiftetoepassingen met echografie. Microbubbels die oscilleren in de opsluiting van een bloedvat kunnen microstreaming veroorzaken, evenals lokale normale en schuifspanningen op de capillaire wand3. Bij hoge akoestische druk kunnen grote amplitude-oscillaties leiden tot microbubbelinstorting in een gewelddadig proces dat traagheidsholtatie wordt genoemd, wat op zijn beurt kan leiden tot breuk of invaginatie van het bloedvat20. Deze gewelddadige verschijnselen kunnen bio-effecten veroorzaken zoals sonopermeatie21, waardoor de extravasatie van therapeutische geneesmiddelen in het interstitium over de endotheelwand wordt verbeterd, paracellulair of transcellulair. Het kan ook de penetratie van therapeutische middelen verbeteren via de extracellulaire matrix van stromarijke tumoren21,22 en biofilms23,24, hoewel dit mechanisme nog steeds slecht wordt begrepen26.
Echografie-gemedieerde medicijnafgifte heeft veelbelovende resultaten laten zien, zowel preklinisch27,28 als in klinische onderzoeken22. Bovendien is gemeld dat microbubbels bij gebruik met relatief laagfrequente echografie (~ 1 MHz) lokaal en tijdelijk de bloed-hersenbarrièredoorlaatbaarheid verhogen, waardoor geneesmiddelen het hersenparenchym kunnen binnendringen, zowel in preklinische als klinische studies29,30,31,32,33,34.
Er zijn over het algemeen twee benaderingen voor echografie-gemedieerde medicijnafgifte: het therapeutische materiaal kan gelijktijdig met de bubbels worden toegediend, of het kan worden bevestigd aan of geladen in de bubbelschaal28,35,36. De tweede benadering is efficiënter gebleken in termen van medicijnafgifte37. Microbubbels kunnen worden geladen met geneesmiddelen of genetisch materiaal ingekapseld in nanodeeltjes (liposomen of polymere nanoconstructen) die aan de schaal zijn bevestigd of direct in de microbubbelschaal zijn opgenomen35,36. Microbubbels met nanodeeltjes kunnen worden geactiveerd door (gerichte) echografie om de nanodeeltjeslading lokaal vrij te geven28,33,38,39,40. Als zo’n microbubbel in direct contact staat met een cel, is in vitro aangetoond dat de lading zelfs op het cytoplasmatische membraan van de cel kan worden afgezet in een proces dat sonoprinting wordt genoemd34,35.
De ultrasone parameterruimte voor microbubbelinsonatie is uitgebreid en de in vivo biologische omstandigheden voegen de complexiteit verder toe. De combinatie van gerichte echografie en microbubbels met nanodeeltjes vormt dus een uitdaging op het gebied van gerichte therapieën.
Het doel van dit werk is om protocollen te bieden die kunnen worden gebruikt om de respons van microbubbels in detail in beeld te brengen als een functie van de ultrasone parameters en om de mechanismen te bestuderen die leiden tot shell-ruptuur en daaropvolgende afgifte van het fluorescerend gelabelde shell-materiaal. Deze set protocollen is van toepassing op microbubbels met schelpen die een fluorescerende kleurstof bevatten. Figuur 1 toont een schematische weergave van de polymere-nanodeeltjes-en-eiwit-gestabiliseerde microbubbels ontwikkeld bij SINTEF (Trondheim, Noorwegen). Deze bellen zijn gevuld met perfluorpropaangas (C3F8) en de nanodeeltjes die de schaal stabiliseren bevatten NR668, een lipofiel derivaat van Nijlrood fluorescerende kleurstof38,43. De nanodeeltjes bestaan uit poly(2-ethyl-butylcyanoacrylaat) (PEBCA) en zijn PEGylated. Functionalisatie met polyethyleenglycol (PEG) vermindert opsonisatie en fagocytose door het mononucleaire fagocytensysteem, waardoor de circulatietijd wordt verlengd14,44. Als gevolg hiervan verhoogt PEGylation de hoeveelheid nanodeeltjes die de doellocatie bereiken, waardoor de werkzaamheid van de behandeling wordt verbeterd16. Figuur 2 illustreert hoe het gebruik van vier microscopiemethoden onderzoekers in staat stelt om alle relevante tijd- en lengteschalen te bestrijken. Opgemerkt moet worden dat de ruimtelijke resolutie die haalbaar is in optische microscopie wordt bepaald door de diffractielimiet, die afhankelijk is van de golflengte van het licht en het numerieke diafragma (NA) van het objectief en die van de objectverlichtingsbron45. Voor de systemen bij de hand is de optische resolutielimiet meestal 200 nm. Bovendien kan intravitale microscopie worden gebruikt om op subcellulair niveau in beeld te brengen46. Voor de nanodeeltjes-en-eiwit-gestabiliseerde microbubbels die in dit werk worden gebruikt, is de minimale lengteschaal die relevant is voor intravitale microscopie de grootte van kleine haarvaten (≥10 μm). In vitro high-speed optische beeldvorming (10 miljoen frames per seconde) en high-speed fluorescentie beeldvorming (500.000 frames per seconde) experimenten worden beschreven voor enkele microbubbels. High-speed bright-field imaging op nanoseconde tijdschalen is geschikt om de tijd-opgeloste radiale dynamiek van de trillende bellen te bestuderen. Daarentegen maakt snelle fluorescentiemicroscopie directe visualisatie mogelijk van de afgifte van de fluorescerend gelabelde nanodeeltjes. Bovendien kan de structuur van de microbubbelschaal worden onderzocht met behulp van Z-stack driedimensionale (3D) confocale microscopie en scanning elektronenmicroscopie (het protocol voor de laatste is niet opgenomen in het huidige werk). Intravitale microscopie bestaat uit het gebruik van multifotonenmicroscopie om tumoren die groeien in dorsale vensterkamers in beeld te brengen om real-time informatie te verstrekken over de lokale bloedstroom en over het lot van fluorescerend gelabelde nanodeeltjes in vivo47. De combinatie van deze microscopiemethoden geeft uiteindelijk gedetailleerd inzicht in het gedrag van therapeutische microbubbelmiddelen in reactie op echografie, zowel in vitro als in vivo.
Verschillende optische microscopiemethoden werden gecombineerd om informatie te verkrijgen over de verschillende stappen in de afgifte van nanodeeltjes van het oppervlak van microbubbels naar het omringende medium. Beeldvorming van de bellenoscillaties werd uitgevoerd, evenals beeldvorming van de afgifte van de nanodeeltjes uit de bellenschil, de extravasatie en de penetratie door de extracellulaire matrix van tumoren in vivo. In vitro beeldvorming maakt screening van veel ultrasone parameters mogelijk in vergelijking met de meer complexe in vivo opstellingen. Het voordeel van het combineren van deze reeks beeldvormingsmodaliteiten is de aanvullende informatie die op verschillende tijdschalen kan worden verkregen – een functie die cruciaal is om de microbubbels te karakteriseren en te optimaliseren voor een succesvolle bevalling en om therapeutische werkzaamheid te verkrijgen. Deze aanpak is nuttig om de afgiftemechanismen voor alle microbubbels te begrijpen, inclusief constructies met fluorescerend gelabelde nanodeeltjes en medicijnen.
De meest kritieke stappen in de microscopiemethoden die worden gebruikt om enkele microbubbels te bestuderen, zijn als volgt. Voor fluorescentiemicroscopie moeten de nanodeeltjes fluorescerend worden gelabeld om visualisatie van de deeltjesafgifte mogelijk te maken. Bovendien moet de monsteroplossing voldoende worden verdund om afzonderlijke microbubbels te isoleren voor analyse in confocale, helderveld- en fluorescentiemicroscopiemethoden. Daarnaast is het belangrijk om een ultrasone rijfrequentie en akoestische druk te kiezen om de bellen het meest efficiënt te prikkelen, namelijk bij hun resonantie. Als de onderzoeksvraag betrekking heeft op de levering van de nanodeeltjeslading, moeten de juiste ultrasone parameters deel uitmaken van het onderzoek. Naast resonantie moeten deze bellen ook op of boven hun drempel voor het vrijkomen van nanodeeltjes worden aangedreven, meestal bij relatief hoge akoestische drukamplitudes (MI > 0,3)51. Voor bright-field microscopiebeelden is het van cruciaal belang om een hogesnelheidscamera te kiezen met een voldoende hoge framerate om bewegingsonscherpte te minimaliseren en aliasing te voorkomen.
Bright-field microscopie wordt voornamelijk beperkt door de beeldframerate en intensiteit van beschikbare lichtbronnen, omdat een hogere framerate een gedetailleerder tijdsgeoploeteerd inzicht in de beldynamiek zou geven, maar een intensere verlichting vereist vanwege kortere belichtingstijden. Om de afgifte van deeltjes in meer detail te bestuderen, kan de framerate voor fluorescentiebeeldvorming in principe worden verhoogd door de intensiteit van het laserlicht te verhogen. Absorptie van het laserlicht met hoge intensiteit door de fluorescerend gelabelde microbubbels genereert echter warmte, zelfs met kleurstoffen met een hoge kwantumopbrengst. Deze hitte kan de experimenten die op het spel staan verstoren en in extreme gevallen fotothermische cavitatie veroorzaken52. In de praktijk is er dus een limiet aan de toegepaste laserfluence. Intense laserverlichting kan echter ook opzettelijk worden gebruikt om deeltjesafgifte van liposomen te induceren53. Temperatuur beïnvloedt de bubbeldynamiek en ultrasone respons, afhankelijk van het type bubbel54. Als in vitro en intravitale methoden objectief moeten worden vergeleken, moeten de in het protocol besproken in vitro methoden daarom bij 37 °C worden uitgevoerd. Een andere beperking van de in vitro methoden die in het huidige artikel worden besproken, is dat de bellen zich niet in een vrije veldomgeving bevinden, omdat microbubbels onder het membraan van de monsterhouder zullen zweven. Bovendien is er een selectiebias bij het afbeelden van enkele microbubbels. Het uitvoeren van herhaalde experimenten op enkele bellen maakt het echter mogelijk om het effect van grootte en verwijdering van de verstorende factor – de grootteverdeling – te onderzoeken. Als de belrespons als functie van grootte kan worden begrepen terwijl de concentratie niet te hoog is om bubbel-bubbelinteracties te voorkomen, kan de respons van een willekeurige bubbelpopulatie worden berekend. Ten slotte geven zowel bright-field- als fluorescentiemicroscopiemethoden inzicht in microbubbels die ingewikkeld zijn in een tweedimensionaal (2D) beeld. Als de onderzoeksvraag meer dan 2D-beeldvorming vereist, kan het 3D-gedrag van de bellen worden opgelost door de in het protocol beschreven opstelling te combineren met een zijaanzichtopstelling voor multiplane imaging55.
Een alternatieve methode om microbubbels te bestuderen is akoestische karakterisering56. Het meten van de echo van een enkele microbubbel vereist echter het lokaliseren en isoleren van een enkele microbubbel in de ultrasone straal56, wat een uitdaging vormt die meestal wordt aangepakt door het gebruik van een smalle buis of een optisch of akoestisch pincet57,58. Om bubbels akoestisch te dimensioneren, kunnen de microbubbels worden geïnsoneerd in het geometrische verstrooiingsregime op frequenties die veel hoger zijn dan hun resonantiefrequentie, wat geen volumetrische microbubbeloscillaties induceert59. Het gebruik van een “akoestische camera” is zo’n methode om de radiale dynamiek van enkele microbubbels in beeld te brengen als reactie op echografie, waarbij een hoogfrequente ultrasone sonde wordt gebruikt om de radiale respons van de bel op een laagfrequente aandrijfgolf te bepalen60. Het nadeel van deze methode is dat deze alleen kan worden gebruikt om de relatieve verandering van de microbubbelradius te bepalen; daarom is een andere methode nodig om de absolute belstraal te bepalen, bijvoorbeeld door middel van optische beeldvorming61,62. Het nadeel van methoden waarbij microbubbels worden blootgesteld aan echografie bij frequenties hoger dan hun resonantiefrequentie is dat bij dergelijke hoge frequenties de penetratiediepte wordt verminderd59, waardoor de bruikbaarheid voor in vivo toepassingen wordt beperkt. Andere vormen van microscopie kunnen ook worden gebruikt om microbubbels te bestuderen, zoals scanning elektronenmicroscopie, atoomkrachtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie63. De haalbare spatio-temporele resolutie van deze alternatieve microscopietechnieken is echter over het algemeen beperkter en deze technieken hebben het nadeel dat beeldvorming vóór of na ultrasone blootstelling wordt uitgevoerd door middel van offline analyse en meestal een lage doorvoer vertoont63. Een ander alternatief is om een lichtverstrooiingsmethode te gebruiken, die kan worden gebruikt om de radiale dynamica van enkele microbubbels in realtime te bestuderen, maar een lage signaal-ruisverhouding heeft in vergelijking met akoestische verstrooiingsmethoden64.
Real-time intravitale microscopie tijdens ultrasone blootstelling is een krachtige methode om nieuw inzicht te krijgen in de vasculatuur, het gedrag van microbubbels, nanodeeltjes of andere moleculen (zoals dextran in dit geval) tijdens ultrasone blootstelling. Een algemene beperking bij het uitvoeren van real-time intravitale microscopie is dat slechts een klein deel van het weefsel in beeld wordt gebracht en de penetratiediepte van het licht in het weefsel beperkt is. Als de afgebeelde vaten zeer weinig microbubbels en/of nanodeeltjes binnen het gezichtsveld bevatten, kan weinig of geen informatie over het gedrag en de extravasatie van de nanodeeltjes worden verkregen. Daarnaast is vanwege het beperkte gezichtsveld een goede uitlijning tussen de licht- en echografiepaden cruciaal. Als de ultrasone druk hoog genoeg is om bellenvernietiging te induceren, is het ook belangrijk om een pulsherhalingsfrequentie te kiezen waarmee verse bellen tussen ultrasone pulsen in het gezichtsveld kunnen komen. Bovendien, omdat de echografie wordt gereflecteerd door het afdekglas in de raamkamer en het objectief, is het belangrijk om de transducer onder een hoek te plaatsen om reflecties te verminderen om de vorming van staande golven te voorkomen, die het gekalibreerde drukveld vervormen. Een ander praktisch probleem is dat de opstelling voldoende ruimte moet hebben om de ultrasone transducer en golfgeleider boven of onder het objectief in de microscoopopstelling te monteren. De tumoren in de dorsale vensterkamer hebben een beperkte dikte vanwege de beperkende kamer en de afdekplaat; indien nodig kunnen echter andere modellen worden gebruikt. Voorbeelden zijn huidplooitumoren, bijvoorbeeld in het borstvetkussen65 of abdominale intravitale beeldvorming van tumoren in de verschillende organen66. Dergelijke tumoren kunnen orthotopisch worden gekweekt in de juiste micro-omgeving en als zodanig een meer klinisch relevant geval presenteren.
De methoden die in dit werk worden beschreven, verlichten het potentieel van fluorescerend gelabelde microbubbels om de fundamenten van medicijnafgiftetoepassingen te bestuderen met behulp van bubbels en echografie. Deze combinatie van microscopiemethoden biedt waardevol inzicht in de microbubbelrespons op ultrasone insonatie en de bijbehorende akoestische parameterruimte en geeft een duidelijk beeld van het microbubbel- en payloadgedrag over een relevant bereik van tijd- en lengteschalen.
The authors have nothing to disclose.
100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026 | Tabor Electronics | Arbitrary waveform generator (programmable) | |
2100 L | ENI | Amplifier, used in window chamber setup | |
2 MDa dextran | Sigma-Aldrich | ||
33522 A | Agilent Technologies | Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup | |
A1R | Nikon Instruments | Confocal microscope | |
ACE I | SCHOTT | Dimmable AC halogen light source | |
Atipemazol | Orion Pharma | Antidote to wake animal | |
Baytril | Bayer | Enrofloxacin | |
BD Neoflon 24 G | Becton Dickinson & Company | Tail vein catheter | |
BNC model 575 | Berkely Nucleonics Corporation | Pulse/delay generator | |
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Branson | Ultrasonic bath | |
Channel slide | Ibidi | ||
CLINIcell 25 | Laboratoires Mabio International | Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 µm) | |
Cohlibri | Lightline | Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm) | |
DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | Oscilloscope | |
Fentanyl | Actavis Group HF | Anaesthesia of mouse | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | Supplement for cell culture medium | |
Fiber-optic hydrophone | Precision Acoustics | Used for alignment | |
Flumanezil | Fresenius Kabi | Antidote to wake animal | |
Heated animal holder | Custom design | A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37°C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber | |
Hyper Vision HPV-X2 | Shimadzu | High-speed camera | |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin | open source image processing program | |
In vivo SliceScope | Scientifica | Multiphoton microscope | |
Isoflurane | Baxter | ||
ISOTON | Beckman Coulter | Filtered, phosphate-buffered saline solution | |
LUMPLFLN60XW | Olympus | Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm) | |
MaiTai DeepSee | Spectra-Physics | Pulsed laser | |
MATLAB | Mathworks | Programming environment | |
Medetomidine | Orion Pharma | Anesthesia of mouse | |
Midazolam | Accord Healthcare Limited | Anesthesia of mouse | |
Milli-Q | Merck | Ultrapure water | |
MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe | PerkinElmer | Strobe light | |
Panametrics-NDT C305 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1", diameter 1") | |
Panametrics-NDT V304 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88", diameter 1.25") | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
Perfluoropropane gas | F2 Chemicals | ||
Roswell Park Memorial Institute 1640 | Gibco Thermo-Fisher | Cell culture medium | |
Safe-Lock tube | Eppendorf | ||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
T 25 basic ULTRA-TURRAX | IKA laboratory technology | Dispersion tool | |
TDS 210 | Tektronix | Oscilloscope, used in window chamber setup | |
Transducer | Precision Acoustics Ltd | Used in window chamber setup | |
U-TLU | Olympus | Tube lens | |
VBA100-200 | Vectawave | Amplifier | |
Window chambers | Custom made | Used in window chamber setup | |
XLUMPLFLN20 XW | Olympus | 20x water dipping objective | |
XY(Z) translation stages | Thorlabs |