Monitoramento multissuso para identificação de convulsões, arritmias e apneia em coelhos conscientes contidos
Summary
Utilizando vídeo simultâneo EEG-ECG-oximetria-capnografia, desenvolvemos uma metodologia para avaliar a suscetibilidade de modelos de coelhos para desenvolver arritmias provocadas e convulsões. Este novo sistema de gravação estabelece uma plataforma para testar a eficácia e a segurança da terapêutica e pode capturar a complexa cascata de eventos multi-sistemas que culminam em morte súbita.
Abstract
Pacientes com canalopatias de íons têm alto risco de desenvolver convulsões e arritmias cardíacas fatais. Há maior prevalência de doenças cardíacas e arritmias em pessoas com epilepsia (ou seja, coração epiléptico.) Além disso, distúrbios cardíacos e autônomos foram relatados em torno de convulsões. 1:1.000 pacientes com epilepsia/ano morrem de morte inesperada súbita na epilepsia (SUDEP). Os mecanismos para a SUDEP permanecem incompletamente compreendidos. Eletroencefalogramas (EEG) e eletrocardiogramas (ECG) são duas técnicas rotineiramente utilizadas no cenário clínico para detectar e estudar os substratos/gatilhos para convulsões e arritmias. Embora muitos estudos e descrições dessa metodologia estejam em roedores, sua atividade elétrica cardíaca difere significativamente dos humanos. Este artigo fornece uma descrição de um método não invasivo para gravação simultânea de vídeo-EEG-ECG-oximetria-capnografia em coelhos conscientes. Como a função elétrica cardíaca é semelhante em coelhos e humanos, os coelhos fornecem um excelente modelo de estudos diagnósticos e terapêuticos translacionais. Além de delinear a metodologia de aquisição de dados, discutimos as abordagens analíticas para o exame da função elétrica neuro-cardíaca e da patologia em coelhos. Isso inclui detecção de arritmia, análise espectral do EEG e uma escala de convulsão desenvolvida para coelhos contidos.
Introduction
A eletrocardiografia (ECG) é rotineiramente utilizada no cenário clínico para avaliar a dinâmica da condução elétrica cardíaca e o processo de ativação-recuperação elétrica. O ECG é importante para detectar, localizar e avaliar o risco de arritmias, isquemias e infartos. Normalmente, os eletrodos são afixados no peito, braços e pernas do paciente, a fim de fornecer uma visão tridimensional do coração. Uma deflexão positiva é produzida quando a direção da despolarização do miocárdio é para o eletrodo e uma deflexão negativa é produzida quando a direção da despolarização do miocárdio está longe do eletrodo. Os componentes eletrográficos do ciclo cardíaco incluem despolarização atrial (onda P), condução arrial-ventricular (intervalo P-R), excitação ventricular (complexo QRS) e repolarização ventricular (onda T). Há grandes semelhanças no ECG e medidas potenciais de ação em muitos mamíferos, incluindo humanos, coelhos, cães, cobaias, porcos, cabras e cavalos1,2,3.
Coelhos são um modelo ideal para pesquisa translacional cardíaca. O coração do coelho é semelhante ao coração humano em termos de composição do canal de íons, e propriedades potenciais de ação2,4,5. Coelhos têm sido usados para a geração de modelos genéticos, adquiridos e induzidos por drogas de doenças cardíacas2,4,6,7,8. Há grandes semelhanças no ECG cardíaco e resposta potencial de ação a drogas em humanos e coelhos7,10,11.
A frequência cardíaca e o processo de ativação elétrica cardíaca é muito diferente em roedores, em comparação com coelhos, humanos e outros mamíferos maiores12,13,14. O coração de roedor bate ~10 vezes mais rápido que os humanos. Em contrapartida, para o segmento ISO-elétrico ST em ECGs humanos e coelhos, não há segmento ST em roedores14,15,16. Além disso, os roedores têm uma forma de onda QRS-r com uma onda T invertida14,15,16. As medições do intervalo QT são muito diferentes em roedores vs. humanos e coelhos14,15,16. Além disso, os valores normais de ECG são muito diferentes em humanos vs. roedores12,15,16. Essas diferenças nas formas de onda do ECG podem ser atribuídas a diferenças na morfologia potencial de ação e nos canais de íons que impulsionam a repolarização cardíaca9,14. Enquanto a corrente transitória de potássio externo é a maior corrente de repolarização na morfologia potencial de ação cardíaca curta (não-cúpula) em roedores, em humanos e coelhos há uma grande cúpula fase-2 sobre o potencial de ação, e as correntes de potássio retificadora atrasadas (IKr e IKs) são as principais correntes repolarizantes em humanos e coelhos4,9,13,17. É importante ressaltar que a expressão de IKr e IKs é ausente/mínima em roedores, e devido à ativação temporal cinética de IKr e IKs não tem um papel na ação cardíaca potencial morfologia9,13. Assim, os coelhos fornecem um modelo mais translacional para avaliar os mecanismos de anormalidades e arritmias induzidas, adquiridas e herdadas de drogas4,7,13. Em seguida, como inúmeros estudos têm mostrado a presença de anormalidades elétricas neuronais e cardíacas em doenças cardíacas primárias (Síndrome de QT Longo18,19,20) ou doenças neuronais (epilepsia21,22,23,24), é importante estudar os mecanismos subjacentes em um modelo animal que reproduz de perto a fisiologia humana. Embora os roedores possam ser suficientes para modelar o cérebro humano, os roedores não são um modelo ideal de fisiologia cardíaca humana7.
A eletroencefalografia (EEG) utiliza eletrodos, geralmente colocados no couro cabeludo ou intracranianamente, para registrar a função elétrica cortical. Estes eletrodos podem detectar alterações na taxa de disparo e sincronicidade de grupos de neurônios piramida próximos no córtex cerebral25. Essas informações podem ser usadas para avaliar a função cerebral e o estado de despertar/sono. Além disso, os EEGs são úteis para localizar a atividade epiepiforme e distinguir convulsões epilépticas de eventos não epilépticos (por exemplo, atividade psicogênica não epiléptica e eventos cardiogênicos). Para diagnosticar o tipo de epilepsia, provocando fatores e a origem da convulsão, os pacientes com epilepsia são submetidos a diversas manobras que podem provocar uma convulsão. Vários métodos incluem hiperventilação, estimulação fótica e privação do sono. Este protocolo demonstra o uso de estimulação fótica para induzir aberrações e apreensões de EEG em coelhos26,27,28,29.
Gravações simultâneas de vídeo-EEG-ECG têm sido amplamente utilizadas em humanos e roedores para avaliar a atividade comportamental, neuronal e cardíaca durante os estados pré-ictal, ictal e pós-ictal30. Embora vários estudos tenham realizado gravações de EEG e ECG separadamente em coelhos4,31,32,33, um sistema para aquisição e análise de vídeo simultâneo-EEG-ECG no coelho consciente contido não está bem estabelecido34. Este artigo descreve o desenho e a implementação de um protocolo que pode gravar dados simultâneos de vídeo-EEG-ECG -capnografia-oximetria em coelhos conscientes, a fim de avaliar a função elétrica e respiratória neuro-cardíaca. Os resultados obtidos a partir deste método podem indicar a suscetibilidade, gatilhos, dinâmica e concordância entre arritmias, convulsões, distúrbios respiratórios e manifestações físicas. Uma vantagem do nosso sistema experimental é que adquirimos gravações conscientes sem a necessidade de um sedativo. Os coelhos permanecem nos contentores por ≥5 h, com movimento mínimo. Como anestésicos perturbam a função neuronal, cardíaca, respiratória e autônoma, as gravações durante o estado consciente fornecem os dados mais fisiológicos.
Este sistema de gravação pode, em última análise, fornecer insights detalhados para avançar na compreensão dos mecanismos neurológicos, cardíacos e respiratórios para morte súbita inesperada em epilepsia (SUDEP). Além do monitoramento neurológico e cardíaco acima, evidências recentes também apoiaram o papel da insuficiência respiratória como potencial contribuição para a morte súbita após uma convulsão35,36. Para monitorar o estado respiratório dos coelhos, foram implementadas oximetria e capnografia para avaliar o estado do sistema respiratório antes, durante e depois de uma convulsão. O protocolo aqui apresentado foi concebido com o objetivo de avaliar o limiar para convulsões de coelhos induzidos por farmacologicamente e estímulos fóticos. Este protocolo pode detectar sutis anormalidades de EEG e ECG que podem não resultar em manifestações físicas. Além disso, este método pode ser usado para testes de segurança cardíaca e eficácia anti-arrítmica de novas drogas e dispositivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta configuração experimental facilita gravações e análises simultâneas de vídeo e EEG-EEG-ECG-oximetria-capnografia em coelhos, particularmente em modelos de doenças cardíacas e/ou neuronais. Os resultados deste artigo mostram que este método é capaz de detectar convulsões e arritmias e diferenciá-las de artefatos eletrográficos. Os resultados esperados foram obtidos ao dar aos coelhos um provulsivo, o que induziu convulsões. Os dados obtidos a partir das gravações de vídeo-EEG puderam ser ainda mais …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem que este estudo foi apoiado por subsídios da American Heart Association, American Epilepsy Society e SUNY Upstate Department of Pharmacology.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP – Flexible Container | PFIZER (HOSPIRA) | 7983-09 | Dilutant |
| 10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle | Sur-Vet | SS-10L2025 | Used as a flush after drug injection |
| 4×4 gauze sponges | Fisher Scientific | 22-415-469 | Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter |
| Apple Sauce | Kirkland | 897971 | Vehicle for oral medications |
| Computer | Dell | Optiplex 5040 | Acquisition computer |
| E-4031 | Tocris | 1808 | Agent known to prolong the QT interval |
| ECG Electrode | RhythmLink | RLSND116-2.5 | 13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes |
| EEG Electrode | RhythmLink | RLSP513 | 5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes |
| EEGLAB (2020) | Swartz Center for Computational Neuroscience | Open Access | Can perform spectral analysis of EEG |
| Ethernet-to-ethernet adapter | Linksys | USB3G16 | Adapter for connecting the camera to the computer |
| Euthanasia-III Solution | Med-Pharmex | ANADA 200-280 | Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance |
| Foam padding | Generic | N/A | Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression |
| Heparin Lock Flush | Medline | EMZ50051240 | To maintain patency of angiocatheter |
| IR Light | Bosch | EX12LED-3BD-8W | Facilitates recordings in the dark |
| LabChart Pro (2019, Version 8.1.16) | ADInstruments | N/A | ECG Analysis |
| JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge | Smiths Medical | 3060 | Used to catherize marginal ear vein |
| MATLAB (R2019b, Update 5) | MathWorks | N/A | Required to run EEGLAB |
| Microphone | Sony Stereo | ECM-D570P | Recording of audible manifestions of seizures |
| Micropore Medical Tape, Paper, White | 3M | 1530-1 | Used to secure wires and create ear splint |
| Natus NeuroWorks | Natus | LC101-8 | Acquisition and review software |
| Pentylenetetrazol (1 – 10 mg/kg always in 1mL volume) | Sigma-Aldrich | 88580 | Dilutions prepared in saline |
| Photic Stimulator | Grass | PS22 | Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses |
| Plastic wire organizer / bundler | 12Vwire.com | LM-12-100-BLK | Bundle wires to cut down on noise |
| PS 22 Photic Stimulator | Grass Instruments | BZA641035 | Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity |
| PVC pipe | Generic | N/A | Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury |
| Quantum Amplifier | Natus | 13926 | Amplifier / digitizer |
| Quantum HeadBox Amplifier | Natus | 22134 | 64-pin breakout box |
| Rabbit Restrainer | Plas-Labs | 501-TC | Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study. |
| Rubber pad (booster) | Generic | N/A | Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression |
| SpO2 ear clip | NONIN | 61000 | PureSAT/SpO2 |
| SpO2 sensor adapter | NONIN | 13931 | XPOD PureSAT/SpO2 |
| SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output | Sony | SRG-X120 | Impela Camera |
| Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer | Sur-Vet | 13882 | Used to inject intravenous medications |
| Veterinary Injection Plug Luer Lock | Sur-Vet | SRIP2V | Injection plug for inserting the needle for intravenous medication |
| Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply | Covidien | 5110 | To prepare ear vein before catheterization |
References
- Kaese, S., et al. The ECG in cardiovascular-relevant animal models of electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 24 (2), 84-91 (2013).
- Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discovery Today: Disease Models. 5 (3), 185-193 (2008).
- O’Hara, T., Rudy, Y. Quantitative comparison of cardiac ventricular myocyte electrophysiology and response to drugs in human and nonhuman species. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 302 (5), 1023-1030 (2012).
- Brunner, M., et al. Mechanisms of cardiac arrhythmias and sudden death in transgenic rabbits with long QT syndrome. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2246-2259 (2008).
- Lengyel, C., et al. Pharmacological block of the slow component of the outward delayed rectifier current (I(Ks)) fails to lengthen rabbit ventricular muscle QT(c) and action potential duration. British Journal of Pharmacology. 132 (1), 101-110 (2001).
- Baczko, I., Hornyik, T., Brunner, M., Koren, G., Odening, K. E. Transgenic rabbit models in proarrhythmia research. Frontiers in Pharmacology. 11, 853 (2020).
- Rudy, Y., et al. Systems approach to understanding electromechanical activity in the human heart: a national heart, lung, and blood institute workshop summary. Circulation. 118 (11), 1202-1211 (2008).
- Zhu, Y., Ai, X., Oster, R. A., Bers, D. M., Pogwizd, S. M. Sex differences in repolarization and slow delayed rectifier potassium current and their regulation by sympathetic stimulation in rabbits. Archives. 465 (6), 805-818 (2013).
- Nerbonne, J. M., Nichols, C. G., Schwarz, T. L., Escande, D. Genetic manipulation of cardiac K(+) channel function in mice: what have we learned, and where do we go from here. Circulation Research. 89 (11), 944-956 (2001).
- Eckardt, L., et al. Drug-related torsades de pointes in the isolated rabbit heart: comparison of clofilium, d,l-sotalol, and erythromycin. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 32 (3), 425-434 (1998).
- Baczko, I., Jost, N., Virag, L., Bosze, Z., Varro, A. Rabbit models as tools for preclinical cardiac electrophysiological safety testing: Importance of repolarization reserve. Progress on Biophysics and Molecular Biology. 121 (2), 157-168 (2016).
- Richig, J. W., Sleeper, M. M. . Electrocardiography of Laboratory Animals. , (2019).
- Edwards, A. G., Louch, W. E. Species-dependent mechanisms of cardiac arrhythmia: A cellular focus. Clinical Medicine Insights. Cardiology. 11, 1179546816686061 (2017).
- Salama, G., London, B. Mouse models of long QT syndrome. Journal of Physiology. 578, 43-53 (2007).
- Zhang, Y., Wu, J., King, J. H., Huang, C. L., Fraser, J. A. Measurement and interpretation of electrocardiographic QT intervals in murine hearts. American Journal of Physiology. Heart and Circulation Physiology. 306 (11), 1553-1557 (2014).
- Auerbach, D. S., et al. Altered cardiac electrophysiology and SUDEP in a model of dravet syndrome. PLoS One. 8 (10), 15 (2013).
- Aiba, T., Tomaselli, G. F. Electrical remodeling in the failing heart. Current Opinion in Cardiology. 25 (1), 29-36 (2010).
- Auerbach, D. S., et al. Genetic biomarkers for the risk of seizures in long QT syndrome. Neurology. 87 (16), 1660-1668 (2016).
- Anderson, L. L., et al. Antiepileptic activity of preferential inhibitors of persistent sodium current. Epilepsia. 55 (8), 1274-1283 (2014).
- Johnson, J. N., et al. Identification of a possible pathogenic link between congenital long QT syndrome and epilepsy. Neurology. 72 (3), 224-231 (2009).
- Devinsky, O., Hesdorffer, D. C., Thurman, D. J., Lhatoo, S., Richerson, G. Sudden unexpected death in epilepsy: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet Neurology. 15 (10), 1075-1088 (2016).
- Bagnall, R. D., et al. Exome-based analysis of cardiac arrhythmia, respiratory control, and epilepsy genes in sudden unexpected death in epilepsy. Annals in Neurology. 79 (4), 522-534 (2016).
- Frasier, C. R., et al. Channelopathy as a SUDEP biomarker in dravet syndrome patient-derived cardiac myocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 626-634 (2018).
- Glasscock, E. Genomic biomarkers of SUDEP in brain and heart. Epilepsy and Behavior. 38, 172-179 (2014).
- Olejniczak, P. Neurophysiologic basis of EEG. Journal of Clinical Neurophysiology. 23 (3), 186-189 (2006).
- Gastaut, H., Hunter, J. An experimental study of the mechanism of photic activation in idiopathic epilepsy. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 2 (3), 263-287 (1950).
- Fisher, R. S., et al. Photic- and pattern-induced seizures: A review for the Epilepsy Foundation of America Working Group. Epilepsia. 46 (9), 1426-1441 (2005).
- Specchio, N., et al. Diagnosing photosensitive epilepsy: fancy new versus old fashioned techniques in patients with different epileptic syndromes. Brain Development. 33 (4), 294-300 (2011).
- Kasteleijn-Nolst Trenite, D., et al. Methodology of photic stimulation revisited: updated European algorithm for visual stimulation in the EEG laboratory. Epilepsia. 53 (1), 16-24 (2012).
- Mishra, V., Gautier, N. M., Glasscock, E. Simultaneous video-EEG-ECG monitoring to identify neurocardiac dysfunction in mouse models of epilepsy. Journal of Visualized Experiments. (131), e57300 (2018).
- Green, J. D., Maxwell, D. S., Schindler, W. J., Stumpf, C. Rabbit EEG “theta” rhythm: Its anatomical source and relation to activity in single neurons. Journal of Neurophysiology. 23 (4), 403-420 (1960).
- Petersen, J., Diperri, R., Himwich, W. A. The comparative development of the EEG in rabbit, cat and dog. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 17, 557-563 (1964).
- Strain, G. M., Van Meter, W. G., Brockman, W. H. Elevation of seizure thresholds: a comparison of cerebellar stimulation, phenobarbital, and diphenylhydantoin. Epilepsia. 19 (5), 493-504 (1978).
- Cheng, Y., et al. Effectiveness of retigabine against levobupivacaine-induced central nervous system toxicity: A prospective, randomized animal study. Journal of Anesthesia. 30 (1), 109-115 (2016).
- Nascimento, F. A., et al. Pulmonary and cardiac pathology in sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). Epilepsy and Behavior. 73, 119-125 (2017).
- Buchanan, G. F. Impaired CO2-Induced Arousal in SIDS and SUDEP. Trends in Neuroscience. 42 (4), 242-250 (2019).
- Van Egmond, P., Binnie, C. D., Veldhuizen, R. The effect of background illumination on sensitivity to intermittent photic stimulation. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 48 (5), 599-601 (1980).
- Harding, G. F., Fylan, F. Two visual mechanisms of photosensitivity. Epilepsia. 40 (10), 1446-1451 (1999).
- Kuwada, S., Stanford, T. R., Batra, R. Interaural phase-sensitive units in the inferior colliculus of the unanesthetized rabbit: effects of changing frequency. Journal of Neurophysiology. 57 (5), 1338-1360 (1987).
- Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigation. 123 (4), 1798-1808 (2013).
- Xiang, C., et al. Threshold for maximal electroshock seizures (MEST) at three developmental stages in young mice. Zoology Research. 40 (3), 231-235 (2019).
- Ross, K. C., Coleman, J. R. Developmental and genetic audiogenic seizure models: behavior and biological substrates. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 24 (6), 639-653 (2000).
- Faingold, C. L., Randall, M., Tupal, S. DBA/1 mice exhibit chronic susceptibility to audiogenic seizures followed by sudden death associated with respiratory arrest. Epilepsy and Behavior. 17 (4), 436-440 (2010).
