Summary
في هذا البروتوكول يتم وصف طريقة زراعة في المختبر والتحليل الوظيفي للخلايا الجذعية العضلية ، والتي تحافظ على معظم تفاعلاتها مع مكانتها الذاتية.
Abstract
أنسجة العضلات الهيكل العظمي الكبار تؤوي مجموعة من الخلايا الجذعية التي لا غنى عنها لقدرتها على تجديد. عند تلف العضلات، والخلايا الجذعية العضلات ترك حالتها هادئة وتفعيل برنامج الميوجينيك مما يؤدي في نهاية المطاف إلى إصلاح الأنسجة التالفة المصاحبة لتجديد تجمع الخلايا الجذعية العضلات. عوامل مختلفة تؤثر على نشاط الخلايا الجذعية العضلات, من بينها المحفزات الجوهرية ولكن أيضا إشارات من بيئة الخلايا الجذعية العضلات المباشرة, مكانة الخلايا الجذعية. عزل وثقافة الألياف العضلية واحدة مع الخلايا الجذعية العضلية المرتبطة بها يحافظ على معظم التفاعل من الخلايا الجذعية مع مكانتها، وبالتالي، فإن أقرب إمكانية لدراسة وظائف الخلايا الجذعية العضلات السابقين فيفو. هنا، يتم توفير بروتوكول للعزلة والثقافة، ونقل سيرنا و المناعة من الخلايا الجذعية العضلية على الألياف العضلية الخاصة بهم من الماوس EDL(أونسور digitorum longus)العضلات. تسمح الظروف التجريبية المبينة هنا بدراسة الخلايا الجذعية العضلية والتلاعب بها بما في ذلك التحقيق في النشاط العضلي دون الحاجة المتأصلة في التجارب الحيوانية الحية.
Introduction
العضلات الهيكل العظمي في الكبار هو نسيج ما بعد الدييتوتيك تتألف أساسا من الألياف العضلية متعددة النوى، والتي هي الخلايا التأثيرية للحركات الطوعية. لديها قدرة ملحوظة على تجديد، وهي عملية تشبه تكوين الجنين ويخضع لضعف في العمر والمرض1. هذه القدرة التجديدية ضرب من العضلات الهيكل العظمي يعتمد على الخلايا الجذعية العضلية (MuSCs), والتي تسمى أيضا خلايا الأقمار الصناعية بسبب موقعها بين ساركوليما والصفائح القاعدية من الألياف العضلية2,3. تحت ظروف الراحة MuSCs هادئة وتتميز التعبير عن عامل النسخ Pax7 وعلامات quiescence مثل Sprouty14،5،6،7،8. عند التنشيط ، على سبيل المثال ، بعد الإصابة ، تغادر MuSCs الحالة الكئية و upregulate العامل التنظيمي myogenic MyoD9. وPax7/MyoD مزدوجة إيجابية MuSCs تتكاثر وتفرق وبالتالي توليد الخلايا السلائف الميوجينية، والتي غالبا ما يشار إليها أيضا باسم الخلايا الميوبلاستية. تلك الخلايا العضلية ثم مزيد من التفريق إلى myocytes ممدود، وهي عملية تتزامن مع التغيرات الجزيئية والمورفولوجية، على سبيل المثال، وفقدان Pax7 و upregulation التعبير الميوجين10. الخلايا العضلية ثم في نهاية المطاف الصمامات لبعضها البعض أو إلى الألياف العضلية الموجودة وبالتالي إصلاح الأنسجة التالفة. الأهم من ذلك، جزء صغير من الخلايا الجذعية العضلات يعود ال MyoD upregulation وقادرة على تجديد الذات11. يمكن ملاحظة حالة التمايز MuSC والتقدم العضلي بسهولة عن طريق التحقيق في علامات الميوجيني مثل Pax7 و MyoD و Myogenin10.
ثقافة الألياف العضلية واحدة مع MuSCs المجاورة لها هو وسيلة ممتازة للتحقيق في وظائف MuSC في الإعداد السابق فيفو منذ MuSCs تبقى في مكانتها الذاتية12،13. وينظم سلوك MuSCs من خلال إشارات جوهرية وكذلك إشارات خارجية التي تقدمها المتخصصة، وهو موقع تشريحي متخصص يتألف من مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) المحيطة MuSCs وميوفير نفسها. على سبيل المثال ، واحدة من المنظمين extrinsic من الهدوء MuSC هو نوتش الإشارات. هنا، يتم تلقي إشارات الإشارات من قبل MuSCs من كل من الألياف العضلية وECM14،15،16. وعلاوة على ذلك، فإن المتخصصة MuSC مهم للسيطرة على محور تقسيم MuSCs وبالتالي تنظيم مصير الخلية من الخلايا ابنة موسك17،18. بشكل معقول ، يمكن تقييم المعلمات مثل أقسام MuSC غير المتماثلة والتقدم العضلي والتجديد الذاتي بشكل فريد في هذا الإعداد التجريبي. على سبيل المثال، يمكن أن تتشكل مجموعة متعددة الخلايا ناشئة عن MuSC واحد بعد فترة ثقافة 72 ساعة، والتي يمكن التحقيق فيها لحدوث ونسبة مئوية من السكان العضلية متميزة مثل تجديد الذات، وتكاثرها والمزيد من MuSCs8،19،20،21. يمكن تحديد حالة التمايز في MuSCs من خلال التحقيق في التعبير / التعبير المشترك عن Pax7 و MyoD و Myogenin. بعد 72 ح من الثقافة يمكن التمييز بين الخلايا في مجموعة من المعلمات التالية: Pax7 الخلايا فقط هي MuSCs ذاتية التجديد، في حين أن الخلايا الإيجابية المزدوجة Pax7/MyoD تتكاثر / تنشيط MuSCs والمزيد من الخلايا الميوجينية المتمايزةإيجابية 22. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقيق في أرقام الموسك أو العودة إلى دورة/تنشيط الخلية بالإضافة إلى التقدم العضلي المنشأ، على سبيل المثال، من خلال التحليلات القائمة على المناعة استنادا إلى المعلمات الموصوفة أعلاه.
هنا ، يتم وصف السمات الفريدة لبروتوكول العزل والثقافة myofiber ، على سبيل المثال ، الحفاظ على تفاعل MuSC مع مكانتها. الماوس كله EDL (extensor digitorum longus) يتم تشريح العضلات بعناية، هضمها collagenase، وتريتويد جسديا للحصول على الألياف العضلية واحدة مع MuSCs المرتبطة بها لمزيد من الثقافة. وعلاوة على ذلك، يحدد البروتوكول الخطوات اللازمة لترجيح المركبات المخاطية مع الحمض النووي الريبي لإجراء تحليلات وظيفية للجينات المرشحة والتحليلات المتتالية القائمة على المناعة دون الحاجة إلى معدلة وراثيا.
Protocol
ويجب أن يتم التضحية بالحيوانات وفقا للأنظمة الوطنية للتجارب على الحيوانات. تم تنفيذ البروتوكول الموصوف هنا وفقا للمبادئ التوجيهية لمعهد لايبنتز للشيخوخة - معهد فريتز ليبمان وتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/EU (رقم الترخيص لحصاد الأعضاء: O_JvM_18-20). ويرد موجز للخطوات الأساسية للبروتوكول في الشكل 1.
1. إعداد لوحات الثقافة، وسائل الإعلام، وماصة باستور
ملاحظة: جميع المواد والمعدات اللازمة لعزل وثقافة الألياف العضلية واحدة تحتاج إلى أن تكون عقيمة قدر الإمكان. لذلك ، يوصى بعزل الألياف العضلية المفردة تحت غطاء تشريح شبه معقم.
- استخدام HS معقمة (مصل الحصان) لمعطف لوحات زراعة الأنسجة. طلاء يمنع تعلق الألياف العضلية واحدة إلى سطح من البلاستيك. لكل فأر، هناك حاجة إلى 4 آبار من لوحة من 12 بئرا للعزل وعدد مخصص من الآبار من لوحة من 24 بئرا لاستزراعها. احتضان آبار لوحة من 12 بئرا مع 1 مل والآبار من لوحة 24 جيدا مع 0.5 مل من HS لمدة 5 دقائق في RT (درجة حرارة الغرفة)، ثم إزالة HS والسماح للوحات الجافة لمدة 5 دقائق أخرى.
ملاحظة: يمكن جمع HS وإعادة استخدامها لأغراض الطلاء عدة مرات، إذا ظلت معقمة. - إعداد المتوسطة العزلة myofiber عن طريق استكمال DMEM (دولبيكو تعديل النسر المتوسط مع 4.5 غرام / لتر الجلوكوز وبيروفات الصوديوم) مع 20٪ FBS (مصل البقر الجنين)، تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. إضافة متوسطة إلى لوحات العزل المغلفة مسبقا (لوحة 12 بئر، 2-4 مل العزل المتوسطة لكل بئر) ما يقرب من 30 دقيقة قبل العزلة والاعتدال في حاضنة 37 درجة مئوية رطبة مع 5٪ CO2.
- إعداد المتوسطة ثقافة الألياف العضلية عن طريق استكمال DMEM (دولبيكو تعديل النسر المتوسط مع 4.5 غرام / لتر الجلوكوز وبيروفات الصوديوم) مع 20٪ FBS (مصل الجنين البقري) و 1٪ استخراج جنين الدجاج، تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. إضافة 0.5 مل المتوسطة إلى كل بئر من لوحات الثقافة المغلفة مسبقا (لوحة 24 جيدا) ما يقرب من 30 دقيقة قبل العزلة والاعتدال في حاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع 5٪ CO2.
- إعداد محلول الهضم collagenase عن طريق حل 0.2٪ (ث / v) الكولاجينز نوع 1 (من كلوستريديوم histolyticum)في DMEM (دولبيكو تعديل النسر المتوسط مع 4.5 غرام / لتر الجلوكوز وبيروفات الصوديوم)، مرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. لاثنين من EDL (العضلات دي سيتوردوم لونغوس) استخدام محلول كولاجيناز 2.5 مل في أنبوب رد فعل 15 مل معقمة. بالإضافة إلى ذلك، قبل تسخين الحل ~ 10 دقيقة في حمام مائي المتداولة في 37 درجة مئوية قبل بدء العزل.
- إعداد المصاطب باستور معقمة لتريتوريشن العضلات التي هضمها collagenase. استخدام قلم الماس لقطع ماصة باستور.
- لكل فأر، استخدم ماصة كبيرة تحمل فتحة حوالي 0.3 سم وطول حوالي 10-12 سم ومصبوب زجاجي ثان بفتحة صغيرة تبلغ حوالي 0.1 سم وطولها حوالي 22 سم(الشكل 2F).
- قم بتنعيم حواف كل من المصاطب عن طريق تلميع الحرارة مع لهب موقد Bunsen. عقد تلميح ماصة لمدة 5-10 ق في اللهب مع حركة لطيف للسماح بتوزيع الحرارة على قدم المساواة حتى حواف الزجاج الحاد تنعيم.
- مباشرة قبل الاستخدام، معطف كلا النوعين من ماصة الزجاج مع HS العقيمة عن طريق ملء ماصة كاملة مع ~ 2 مل من HS لمدة 5 دقائق، وبعد ذلك، إخراج HS والسماح للمواسير الجافة لمدة 5 دقائق في RT.
2. عزل العضلات EDL والهضم الكولاجينيز
- رش جميع المعدات مع الإيثانول 70٪ لتجنب التلوث.
- التضحية بالفأر وفقا للوائح الوطنية للتجارب على الحيوانات.
- رش الخلفيات من الماوس مع الإيثانول 70٪. استخدم مقص منحني رفيع صلب (حافة القطع 24 ملم) والملقط الدقيق (Dumont 7، منحني أو مستقيم) لإزالة الجلد وفضح العضلات الأساسية. تجنب أي اتصال للعضلات الكامنة مع الفراء (يزيد من خطر التلوث).
- إزالة اللفافة المحيطة بها مع ملقط منحنية غرامة دون الإضرار العضلات الكامنة (الشكل 2A). إغلاق ملقط لتجنب الانحناء.
- استخدام ملقط منحنية لفضح الأوتار البعيدة من TA (الساق الأمامي )والعضلات EDL. لإزالة TA، والاستيلاء على وتر TA البعيدة مع ملقط وقطع مع مقص الربيع فاناس غرامة (5 ملم حافة القطع، قطر تلميح 0.35 ملم). في حين عقد TA في وتر, سحبه نحو الركبة وقطع العضلات قريبة من الركبة (الشكل 2B), يتم الآن عرض عضلة EDL.
ملاحظة: تأكد من أن يتم انتزاع وتر TA فقط في هذه الخطوة، وإلا فإن EDL الأساسية قد تحصل على التالفة. عند قطع عضلة TA تأكد من أن الأوتار في الركبة يمكن أن ينظر إليها بسهولة بعد ذلك. - رفع وتر EDL البعيدة مع ملقط منحنية غرامة وقطع مع مقص الربيع فاناس غرامة (الشكل 2C). فضح وتر EDL القريبة عن طريق سحب بعناية EDL نحو الركبة. قطع وتر قريب مع مقص الربيع فاناس غرامة. نقل العضلات EDL إلى 37 درجة مئوية مسخن 2.5 مل من محلول الهضم collagenase في أنبوب رد فعل 15 مل من الخطوة 1.4. (الشكل 2D).
ملاحظة: إجراء شق صغير في النسيج الضام الركبة الخارجي لفضح تماما وتر EDL القريبة. تأكد من الاستيلاء على الأوتار فقط وعدم تمديد EDL أكثر من اللازم. - كرر الخطوات 2.3. إلى 2.6. مع EDL الثاني. إضافة كل من عضلات EDL إلى نفس أنبوب رد الفعل 15 مل مليئة 2.5 مل كولاجيناز حل الهضم.
- احتضان عضلات EDL في أنبوب رد الفعل في 37 درجة مئوية في حمام مائي متداول.
ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على عدة عوامل، مثل نشاط الكولاجين، وعمر الفأرة، وكمية الأنسجة الليفية. وقت الحضانة النموذجي لعضلات EDL للفئران البالغة (2-6 أشهر من العمر) هو 1-1.5 ساعة وبالنسبة للفئران البالغة من العمر (18 شهرا من العمر) 1.5-2 ساعة. - لتجنب الهضم المفرط للعضلات، تحقق من العضلات خلال فترة الهضم. وقف الهضم عندما تخفف العضلات وألياف عضلية واحدة مرئية (الشكل 2E). نقل العضلات بعناية مع ماصة كبيرة تتحمل إلى البئر الأول من لوحة 12 جيدا prewarmed التي تحتوي على المتوسط العزلة myofiber (الشكل 2G).
3. التفكك Myofiber والثقافة
- للخطوات التالية استخدام مجهر مجهر ستيريو، مجهزة بشكل تفضيلي مع لوحة التدفئة (37 درجة مئوية). استخدام ماصة كبيرة تتحمل لطرد العضلات مع العزلة الدافئة المتوسطة حتى يتم الافراج عن الألياف العضلية واحد. فصل العضلات مع ماصة كبيرة تتحمل حتى العدد المطلوب من الألياف العضلية تطفو بحرية في الحل.
ملاحظة: تجنب الإفراط في التريض للحد من خطر الألياف العضلية التالفة. ينصح بشدة باستخدام لوحة التدفئة لانفصال الألياف العضلية لأن درجة الحرارة تنخفض أثناء عملية العزل ، مما سيؤدي إلى وفاة الألياف العضلية. - نقل الألياف العضلية غير المتعاقد عليها(الشكل 2H)مع HS المغلفة ماصة زجاجية صغيرة تحمل إلى بئر الثاني مليئة العزلة المتوسطة لغسل الحطام والمتعاقدة (التالفة) ألياف (الشكل 2I).
ملاحظة: لتجنب الحركة المفرطة للألياف العضلية المعزولة ، يمكن نقلها إلى البئر الثاني ومن ثم يمكن الاستمرار في عملية التحيب. - نقل الألياف العضلية غير المتعاقد عليها إلى التالي (3rd)مليئة جيدا مع العزلة المتوسطة لغسل مرة أخرى.
- استخدام ماصة زجاجية صغيرة تحمل، المغلفة مع HS، لنقل ما يقرب من 50-100 الألياف العضلية غير المتعاقد عليها إلى لوحة 24 جيدا تحتوي على المتوسط ثقافة الألياف العضلية.
- احتضان الألياف العضلية عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لوقت مخصص (يوصى ب 96 ساعة كحد أقصى).
ملاحظة: MuSCs تقسيم مرة واحدة إما مستو أو apical-القاعدية بعد 42 ساعة من الثقافة. بالإضافة إلى ذلك، بعد 72 ساعة من الثقافة MuSCs تشكيل مجموعات متعددة الخلايا تتكون من تجديد الذات، والانتشار أو ملتزمة (متمايزة) MuSCs.
4. سيرنا transfection
- 4 ساعة بعد عزلة الميوفيبر، يرتبط الميوفيبر المتحول ب MuSCs (50-100 ألياف ميوفيبر غير متعاقد عليها في بئر واحد من لوحة 24 جيدا مليئة ب 500 ميكرولتر متوسطة الثقافة) مع كاشف العدوى القائم على الدهون، على سبيل المثال RNAiMAX وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة بتركيز نهائي قدره 5 pmol siRNA. لذلك، أضف 25 ميكرولتر من Opti-MEM مع الحجم المعني من siRNA إلى 25 ميكرولتر Opti-MEM يحتوي على 1.5 ميكرولتر من كاشف العدوى. احتضان مزيج رد الفعل لمدة 5 دقائق وإضافته ثم إلى 500 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة.
ملاحظة: يوصى بإجراء عملية إعادة إصابة ثانية بعد 24 ساعة أو 48 ساعة لفترات ثقافية أطول، على سبيل المثال، أكثر من 48 ساعة. تغيير متوسط بعد العدوى ليس ضروريا.
5. التثبيت و IF تلطيخ
- للحصول على المناعة استخدام مجهر مناظير ستيريو. يتم ضبط جميع وحدات التخزين في الخطوات التالية إلى بئر واحد من لوحة 24 جيدا. تنفيذ جميع الخطوات التالية باستخدام ماصة صغيرة تتحمل HS المغلفة.
- تجاهل بعناية المتوسطة ثقافة الألياف العضلية في حين ترك بعض الحل في البئر (حوالي 100 ميكرولتر لكل 24 جيدا). القيام بذلك لجميع الخطوات الأخرى ما لم ينص على خلاف ذلك للسماح العائمة من الألياف العضلية. إضافة 500 ميكرولتر من 2٪ PFA لإصلاح الألياف العضلية مع MuSCs المجاورة لها، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إزالة supernatant بعناية وغسل الألياف العضلية ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4، 500 ميكرولتر لمدة 5 دقائق في RT لكل منهما).
- إضافة 500 ميكرولتر حل permeabilization (0.1٪ تريتون X-100، 0.1 M الجليسين في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
- إزالة الحل permeabilization وإضافة 500 ميكرولتر حل حجب (5٪ HS في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4) لمدة 1 ساعة في RT.
ملاحظة: تحقق من الحل حظر المستحسنة للأجسام المضادة الأساسية لتجنب ربط غير محدد. - إزالة حل الحجب وإضافة 300 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، المضادة ل Pax7 (PAX7، DSHB، غير مخفف)، المضادة للميو دي (استنساخ G-1، سانتا كروز، 1:200)) في بئر. حضانة عند 4 °C بين عشية وضحاها.
- غسل ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر (5 دقائق في RT).
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 300 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، مكافحة الماوس-IgG1-546 ومكافحة الماوس-IgG2b-488 1:1000) لكل بئر. احتضان 1 ساعة في RT محمية من الضوء. للخطوات التالية، ينصح بتقليل الضوء.
- غسل مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر (5 دقائق في RT).
- تنفيذ تلطيخ DAPI باستخدام 500 ميكرولتر من الحل لكل بئر (تركيز DAPI النهائي 10 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق في RT.
- غسل مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر (5 دقائق في RT).
- استخدام قلم مسعور لرسم دائرة على شريحة زجاجية مجهرية لإنشاء حاجز طارد المياه التي من شأنها منع تسرب السائل الذي يحتوي على ألياف الميوبر. نقل الألياف العضلية في أصغر حجم ممكن إلى الشريحة الزجاجية المجهرية وتفريقها على الشريحة الزجاجية.
ملاحظة: تجنب السحب المادي للألياف العضلية على الشريحة الزجاجية المجهرية لأن هذا قد يسبب احتكاكا يؤدي إلى انفصال المجموعات عن الألياف العضلية. - إزالة السائل المتبقي مع ماصة باستور الصغيرة أو ماصة 200 ميكرولتر.
- استخدام قطرتين من المتوسط تصاعد مائي وتغطية الألياف العضلية مع غطاء. دع الشرائح تجف للوقت الذي أوصت به الشركة المصنعة. تخزين الشرائح في 4 درجة مئوية في الظلام.
Representative Results
يوفر هذا البروتوكول تعليمات للنجاح في اشتقاق وثقافة الألياف العضلية المفردة مع الأجهزة الميوسة المرتبطة بها من عضلات مورين EDL. ويرد موجز للخطوات الأساسية للبروتوكول في الشكل 1. تشريح دقيق من وتر إلى وتر من عضلات EDL (الشكل 2A-C) أمر بالغ الأهمية لغلة عالية من الألياف العضلية قابلة للحياة. ويتحقق تشتت العضلات أولا عن طريق الهضم collagenase (الشكل 2D) تليها التريتوريشن الجسدي (الشكل 2G). الألياف العضلية سليمة (الشكل 2H) هي مثقفة، في حين أن الألياف العضلية المتعاقد عليها بشكل مفرط والميتة(الشكل 2I)ينبغي استبعادها من الثقافة والتحليل.
تبقى MuSCs المرتبطة بالألياف العضلية أثناء عملية العزل. Immunofluorescence تلطيخ لعامل النسخ Pax7 يحدد ويميز 7-9 نواة MuSC من عدد كبير من الميونوكلي لكل الألياف العضلية عندما ثابتة مباشرة بعد الانتهاء من عملية العزل (الشكل 3A). يظهر الشكل 3B منطقة مكبرة من الشكل 3A مع قناة brightfield إضافية، والذي يكشف عن البنية العضلية الرجفان دون الخلوية من myotube ويوضح إشارة Immunofluorescence Pax7 في نواة MuSC.
تفعيل وتطور الميوجينية من الألياف العضلية المرتبطة MuSCs يمكن تحليلها عن طريق التعبير علامة myogenic. المرتبطة الألياف العضلية المعزولة حديثا (0 ساعة)، ويمكن العثور على معظمها MuSCs هادئة، والتي تتميز التعبير Pax7 وعدم وجود التعبير عن ميو دي، وبالتالي تشبه في حالة في الجسم الحي homeostatic (الشكل 4، 0 ساعة). بسبب إجراء تشريح / الفصام وتكوين وسائل الإعلام ثقافة الألياف العضلية ، وMuSCs تنشيط بسرعة و upregulate عامل النسخ MyoD لتسهيل الانتشار كما يمكن ملاحظتها في 42 ساعة ، عندما خضعت MuSCs شعبتهم الأولى(الشكل 4، 42 ح). بعد 72 ساعة من الثقافة، MuSCs تشكيل مجموعات من الذرى مع مصائر الميوجينية المختلفة التي توازيها أنماط التعبير من علامات الميوجينية المختلفة(الشكل 4، 72 ح). الخلايا Pax7+ فقط تقاوم التمايز وتصبح خلايا جذعية ذاتية التجديد. Pax7 + و MyoD + الخلايا الإيجابية المزدوجة هي التكاثر ، في حين أن الخلايا MyoD + فقط قد تقدمت أكثر على طول النسب الميوجيني وسوف تفرق.
يسمح نظام ثقافة الألياف العضلية بالتدخل الفعال لنشاط MuSC من خلال تدخلات مختلفة ، والتي أحدها هو نقل الحمض النووي الريبي كما هو موضح بالتفصيل في هذا البروتوكول. لرصد كفاءة العدوى من الألياف العضلية المرتبطة MuSCs تم نقل سيرنا المسمى فلوريا غير المستهدفة. Pax7 الموسك إيجابية تراكمت السيتوبلازمية siRNA بطريقة تشبه حبيبات، مما يدل على امتصاص كفاءة(الشكل 5A). لم تلاحظ حبيبات فلورية في السيتوبلازم من الألياف العضلية مما يشير إلى وجود حاجز امتصاص طبيعي في الألياف العضلية عند 4 ساعة بعد العزل وأن العدوى العابرة للسيرنا تستهدف على وجه التحديد MuSCs. كشف القياس الكمي لخلايا Pax7+ المتحولة بشكل إيجابي لكل ألياف ميوفير أن أكثر من نصف جميع MuSCs تناولوا كميات مرئية من الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت قبل الانتهاء من الجولة الأولى من القسم في 24 ساعة. زاد عدد خلايا Pax7+ المصابة بنسبة تصل إلى 74٪ بعد 30 ساعة(الشكل 5B). وعلاوة على ذلك، لم يكن هناك فرق في عدد خلايا Pax7+ لكل ألياف ميوفير من الحالات المصابة أو غير المصابة في كلتا النقطتين الزمنيتين، مما يدل على عدم وجود آثار سلبية على أرقام الخلايا الجذعية بسبب إجراء العدوى(الشكل 5C).
باختصار ، يوفر البروتوكول وصفا مفصلا لعزل وثقافة ألياف عضلية واحدة EDL مع الخلايا الجذعية العضلية المجاورة لها. وهو يمكن من دراسة نشاط الخلايا الجذعية العضلية المرتبطة بالألياف العضلية، على سبيل المثال، من خلال التحليلات القائمة على المناعة. التلاعب في الخلايا الجذعية العضلية عن طريق العدوى سيرنا فعالة ويوفر أساسا منهجيا للتحليلات الوظيفية.
الشكل 1:ملخص تخطيطي للخطوات الأساسية. ويرد في هذا الشكل موجز للخطوات الأساسية لإجراء العزلة والتخسيخ المناعي. الاختصارات: DMEM، متوسط النسر المعدل في دولبيكو؛ FBS، مصل الأبقار الجنينية؛ CEE, استخراج جنين الدجاج; TA, تيبياليس الأمامي ; EDL، extensor digitorum longus يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشريح EDL الماوس وعزلة الألياف العضلية واحدة. (أ) تتم إزالة الجلد من الأطراف الخلفية الماوس ويتم سحب العضلات المحيطة اللفافة بعيدا لفضح TA (tibialis الأمامي )العضلات. (ب) تتم إزالة العضلات TA لفضح EDL (العضلات EDL ( أونسور digitorum longus) ، تميزت السهم الأبيض. (ج) يتم تشريح عضلة EDL عن طريق قطع أوتارها. (د) اثنين من عضلات EDL هي الكولاجين هضمها. (ه) ظهور كولاجيناز هضم العضلات مع الألياف العضلية واحدة مرئية تخفيف من جوهر الأنسجة. (F) ماصة باستور كبيرة وصغيرة تحمل مع الحجم. (G) عضلات EDL (التي تتميز السهام السوداء) هي تتهاون جسديا باستخدام ماصة باستور تتحمل كبيرة. (H)واحد الألياف العضلية سليمة رقيقة ولامعة ويمكن جمعها بشكل فردي للثقافة والتحليل. (I)الألياف العضلية المتعاقد معها والميتة غير مناسبة للثقافة والتحليل. تم التقاط الصور المجهرية من 2H و 2I مع المجهر باستخدام N-Achroplan 5x الهدف. أشرطة المقياس هي 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:صورة مجهرية لغشاء الألياف العضلية واحد كامل مع MuSCs المرتبطة بها. تم إعداد ألياف ميو فايبر واحدة من EDL من الفئران C57BL/6 الشباب وPFA ثابتة بعد العزلة (0 ساعة). (أ)باكس7 وDAPI immunofluorescence تلطيخ يحدد الخلايا الجذعية المرتبطة العضلات الألياف العضلية (MuSCs، تميزت السهام). تم التقاط الصورة المجهرية باستخدام البلاط ووظيفة z-stack لمجهر مجهز بهدف زيت Plan-Apochromat 40x. شريط مقياس هو 200 ميكرومتر. (ب) التكبير من (أ) تظهر myonuclei، نواة واحدة باكس7 إيجابية ونمط مشرق الظلام من هياكل الرجفان العضلي في برايتفيلد. شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور Immunofluorescence لتنشيط MuSC والتقدم العضلي خلال ثقافة الألياف العضلية واحدة. الخلايا الجذعية العضلية (MuSCs) من الألياف العضلية المعزولة حديثا (0 ساعة) تمثل حالة الهوستاتيكية قريبة من في quiescence في الجسم الحي، تتميز بالتعبير عن Pax7 وعدم وجود التعبير عن الميو دي. خلال ثقافة الألياف العضلية واحدة معظم MuSCs upregulate MyoD وإعادة إدخال دورة الخلية لتقسيم وتتكاثر (42 ساعة). بعد 72 ساعة من الثقافة يمكن التمييز مصير MuSC على أساس التعبير علامة myogenic. الخلايا مع Pax7 التعبير فقط سوف تجدد نفسها (السهم الأحمر) في حين Pax7 و MyoD الخلايا الإيجابية المزدوجة (السهم الأحمر / الأخضر) الاستمرار في الانتشار. MyoD فقط الخلايا الإيجابية (السهم الأخضر) قد التزمت التمايز myogenic. تم التقاط صور مجهرية باستخدام مجهر مع هدف Plan-Apochromat 20x (0 ساعة، 42 ساعة) أو هدف LD Plan-Neofluar 40x (72 ساعة). أشرطة المقياس هي 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:الفلورسنت سيرنا transfection من MuSCs وتحليل امتصاص. تم إعداد ألياف EDL المفردة ومربوضة بسيلنا المسمى فلوريا (siGLO) باتباع الخطوات التي يوفرها هذا البروتوكول. (أ)تراكم الخلايا اللاتنسجية من حبيبات siGLO على وجه التحديد في الخلايا الجذعية العضلات الإيجابية Pax7 (MuSC) على ألياف عضلية واحدة في 30 ساعة من الثقافة. تم التقاط الصورة المجهرية باستخدام z-كومة ووظيفة apotome من المجهر مع خطة أبوكرومات 100x هدف النفط. أشرطة مقياس هي 5 ميكرومتر. (ب) كمية امتصاص siRNA بواسطة الخلايا الجذعية العضلات الإيجابية Pax7 في 24 أو 30 ساعة من الثقافة. (ج) عدد الخلايا الإيجابية Pax7 لكل ألياف ميوفير واحدة مقارنة الظروف غير المصابة والمتحولة في 24 أو 30 ساعة من الثقافة. تظهر البيانات على أنها متوسطة مع الانحراف المعياري ل n = 4 فئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هنا، يتم تقديم طريقة للتحقيق وظيفيا دور جين معين في MuSCs باستخدام نهج في المختبر. الأهم من ذلك ، في النظام الموصوف هنا يتم استزراع MuSCs في ظروف تشبه الوضع في الجسم الحي قدر الإمكان الحفاظ على معظم تفاعلات MuSCs مع مكانتها. ويتم ذلك عن طريق زراعة الألياف العضلية المعزولة مع MuSCs المجاورة لها في ظل ظروف عائمة وتوريث سيرنا المتتالي. ويرد وصف لإجراءات عزل الألياف العضلية، ونقل الحمض النووي الريبي ( siRNA) والتحقيق في مجموعات MuSC خلال 72 ساعة من الثقافة من خلال تحليلات الفلورسينس المناعي. وعلاوة على ذلك، ثبت أن حوالي 74٪ من جميع MuSCs تم تحويلها مع siRNA التحكم المسمى الفلورسنت بعد 30 ساعة من الثقافة.
وينبغي تركيز اهتمام خاص على تشريح دقيق للعضلات EDL منذ تمتد واسعة النطاق, معسر, أو الضغط سيؤدي إلى انكماش والموت المتتالي من الألياف العضلية. وعلاوة على ذلك، من المهم التحقيق في مجموعات من MuSCs من ما لا يقل عن 20 ألياف ميو فايبر مختلفة لكل تكرار لكل حالة. وهذا ضروري لأن أرقام وخصائص MuSC تختلف بسبب وجود مجموعات فرعية من MuSC. عند التحقيق في تأثير سيرنا محددة على MuSCs باستخدام طريقة ثقافة الألياف العضلية العائمة ينبغي إجراء مقارنة بين الشرط مع siRNA استهداف إلى التحكم غير استهداف داخل نفس الماوس والعضلات. ويوصى بذلك لتجنب الاختلافات الخاصة بالماوس والتي قد تغطي أو تضخم آثار سيرنا. يمكن تحديد كفاءة الضربة القاضية من خلال تحليلات immunofluorescence مع الأجسام المضادة الموجهة ضد الجين المستهدف باستخدام ألياف الميو فايبر المفردة مع MuSCs المجاورة لها. إذا لم يكن هذا خيارا ، يمكن للمرء اختبار كفاءة الضربة القاضية في الخلايا الميوبلاستية الأولية تليها تحليلات RT-PCR أو المناعة الكمية. وينبغي تحديد كفاءة سيرنا قبل تحليل تأثير سيرنا على MuSCs على ألياف الميوبر واحد. استخدام تجمع الذكية التي تتكون من 4 siRNAs مختلفة مقابل واحد يزيد من كفاءة الضربة القاضية ولكن أيضا يزيد من خطر استهداف غير محدد. وينبغي استخدام siRNA غير المستهدفة كعنصر تحكم. لمراقبة كفاءة العدوى مباشرة ، يمكن للمرء استخدام سيرنا غير المستهدفة الموسومة بالفلورسنت كما يتم تنفيذها هنا. النقطة الزمنية ل transfection مع سيرنا حوالي 4 ساعات بعد العزل، وهي نقطة زمنية عندما الصفيحة القاعدية المحيطة MuSCs نفاذية بالفعل لsiRNA. إذا كان ينبغي التحقيق في تأثير سيرنا محددة على MuSCs بعد 72 أو 96 ساعة، فمن المستحسن لإجراء ثانية سيرنا transfection بعد 24 ساعة أو 48 ساعة للحفاظ على كفاءة ضربة قاضية عالية.
يعرض المقايسة ثقافة الألياف العضلية مزايا متنوعة مقارنة بالتحقيق في MuSCs مع أساليب ثقافة الخلايا التقليدية. تبقى MuSCs مرتبطة بالألياف العضلية خلال عملية العزل بأكملها ، وبالتالي الحفاظ على التفاعل الحاسم ل MuSC مع مكانتها19و23و24و25. التفاعل المحفوظة من MuSCs مع الألياف العضلية هو شرط أساسي لدراسة الآثار المتخصصة تعتمد على وظائف MuSC، والتي لا يمكن تلخيصها في الثقافات التقليدية 2D ميوبلاست. على سبيل المثال، أثناء الشيخوخة MuSCs عرض ضعف قدرة الميوجيني مما أدى إلى انخفاض الكفاءة لتجديد الأنسجة العضلية بعد الضرر20،26. ويعزى هذا الانخفاض جزئيا على الأقل إلى التغيرات في مكانة MuSC ، ولا سيما التغيرات في تكوين ECM27،28. يسمح بروتوكول ثقافة الألياف العضلية بالدراسة والتدخل في هذه التغييرات المتخصصة الشاذة.
وعلى النقيض من الطريقة الموصوفة هنا، فإن تنقية المركبات المخاطية عن طريق تقنيات التصنيف المناعي والفرز مثل FACS (فرز الخلايا المنشطة الفلورية) أو MACS (فرز الخلايا المغناطيسية) تنطوي على إزالة أجهزة MuSCs من مكانتها. ومن المثير للاهتمام، والثقافات 2D من MuSCs معزولة من العضلات القديمة تفقد العظة extrinsic وتتصرف على غرار MuSCs معزولة عن العضلات الشابة وبالتالي لا تلخيص الوضع في الجسم الحي بشكل مناسب29. وعلاوة على ذلك، فإن التفكك الكامل للأنسجة العضلية ووضع العلامات على MuSCs مع علامات السطح يؤدي إلى تغييرات النسخ وتنشيط الخلايا30،31،32. ميزة أخرى لنظام ثقافة الألياف العضلية هي إمكانية التدخل في وظائف MuSC على مختلف المستويات. يمكن تحقيق التلاعب في MuSCs على الألياف العضلية المثقفة بشكل فعال من خلال ضربة قاضية جينية بوساطة siRNA كما هو موضح هنا بالتفصيل. وبالمثل ، فإن تطبيق المركبات الكيميائية أو تسليم البروتينات المؤتلفة فعال جدا للتدخل في مسارات الخلايا الجذعية20،28. وعلاوة على ذلك، تسمح ناقلات التعبير الرجعية أو العدسية بإدخال جينات خارجية المنشأ، أي المسوخ النشطة التأسيسية33. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استكشاف تأثير العوامل الخارجية على وظائف MuSC في النظام الموصوف هنا ، على سبيل المثال ، يمكن استكمال ظروف الثقافة ب supernatant من مصادر فسيولوجية أو مرضية مختلفة لنموذج حالات مختلفة مثل السرطان cachexia34،35.
أحد قيود الطريقة الموصوفة هنا هو حقيقة أن نظام ثقافة الألياف العضلية الوحيد لا يمكن أن يلخص تماما تأثير جميع العوامل النظامية أو تأثير أنواع الخلايا الأخرى على MuSCs. أيضا ، فإن الوقت الذي يمكن أن تبقى فيه الألياف العضلية قابلة للحياة في الثقافة محدودة ، وبالتالي تركز دراسة العمليات ذات الصلة ب MuSC على الأحداث المبكرة مثل التنشيط والالتزام العضلي. وعلاوة على ذلك، فإن التحقيق في تفاعل MuSC مع الخلايا المتخصصة الأخرى مثل الخلايا المناعية أو خلايا السلف الليفية الدهنية غير ممكن. للتحقيق في الآثار الجهازية على وظائف MuSC يمكن للمرء إما إجراء تجارب إصابة العضلات تليها تحليل تجديد العضلات في الجسم الحي أو إجراء تجارب زرع36،37.
ويوفر بروتوكول العزل والثقافة الميوفيبر معا فرصة عظيمة لإجراء دراسات جينية أو ميكانيكية على أجهزة ال موزك البالغة دون الحاجة إلى نماذج فأرة معدلة وراثيا ويمكن أن يقلل من التجارب على الحيوانات.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نشكر كريستين بوسير وكريستينا بيكر على المساعدة التقنية الممتازة والقراءة النقدية للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل بمنحة من مؤسسة دويتشه فوردشونجسجيمينشافت إلى JvM (MA-3975/2-1) ومؤسسة كارل زايس ودويتشه كريبشيلفي (DKH-JvM-861005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
| chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
| collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
| horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
| MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
| siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |
References
- Henze, H., Jung, M. J., Ahrens, H. E., Steiner, S., von Maltzahn, J. Skeletal muscle aging - Stem cells in the spotlight. Mechanisms of Ageing and Development. 189, 111283 (2020).
- Chang, N. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells: the architects of skeletal muscle. Current Topics in Developmental Biology. 107, 161-181 (2014).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysics and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (13), 2559-2570 (2019).
- Motohashi, N., Asakura, A. Muscle satellite cell heterogeneity and self-renewal. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2, 1 (2014).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and culture of individual myofibers and their adjacent muscle stem cells from aged and adult skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 2045, 25-36 (2019).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- Mourikis, P., et al. A critical requirement for notch signaling in maintenance of the quiescent skeletal muscle stem cell state. Stem Cells. 30 (2), 243-252 (2012).
- Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. Journal of Cell Biology. 190 (3), 427-441 (2010).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).
- Troy, A., et al. Coordination of satellite cell activation and self-renewal by Par-complex-dependent asymmetric activation of p38alpha/beta MAPK. Cell Stem Cell. 11 (4), 541-553 (2012).
- Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 21 4543-4548 (2014).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Eliazer, S., et al. Wnt4 from the Niche Controls the Mechano-Properties and Quiescent State of Muscle Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 654-665 (2019).
- Goel, A. J., Rieder, M. K., Arnold, H. H., Radice, G. L., Krauss, R. S. Niche cadherins control the quiescence-to-activation transition in muscle stem cells. Cell Reports. 21 (8), 2236-2250 (2017).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular wisp1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12 (3), 333-344 (2013).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24 (2), 213-225 (2019).
- Judson, R. N., et al. The Hippo pathway member Yap plays a key role in influencing fate decisions in muscle satellite cells. Journal of Cell Science. 125, Pt 24 6009-6019 (2012).
- He, W. A., et al. NF-kappaB-mediated Pax7 dysregulation in the muscle microenvironment promotes cancer cachexia. Journal of Clinical Investigation. 123 (11), 4821-4835 (2013).
- Schmidt, M., Poser, C., von Maltzahn, J.
- Feige, P., Rudnicki, M. A. Isolation of satellite cells and transplantation into mice for lineage tracing in muscle. Nature Protocols. 15 (3), 1082-1097 (2020).
- Garry, G. A., Antony, M. L., Garry, D. J. Cardiotoxin induced injury and skeletal muscle regeneration. Methods in Molecular Biology. 1460, 61-71 (2016).
