I detta protokoll beskrivs en in vitro-odlings- och funktionell analysmetod för muskelstamceller, vilket bevarar de flesta av deras interaktioner med deras endogena nisch.
Vuxen skelettmuskelvävnad hyser en stamcellspopulation som är oumbärlig för dess förmåga att regenerera. Vid muskelskada lämnar muskelstamceller sitt quiescent tillstånd och aktiverar det myogena programmet som i slutändan leder till reparation av skadad vävnad som samtidigt är samtidig med påfyllningen av muskelstamcellspoolen. Olika faktorer påverkar muskelstamcellsaktiviteten, bland annat inneboende stimuli men också signaler från den direkta muskelstamcellsmiljön, stamcellsnisch. Isoleringen och kulturen hos enskilda myofibrer med tillhörande muskelstamceller bevarar det mesta av stamcellens interaktion med dess nisch och är därför den närmaste möjligheten att studera muskelstamcellsfunktionalitet ex vivo. Här tillhandahålls ett protokoll för isolering, kultur, siRNA-transfektion och immunstaining av muskelstamceller på deras respektive myofibrer från musen EDL (extensor digitorum longus) muskler. De experimentella tillstånd som beskrivs här tillåter studier och manipulering av muskelstamceller ex vivo inklusive undersökning av myogen aktivitet utan det inneboende behovet av in vivo djurförsök.
Skelettmuskulaturen hos vuxna är en postmitotisk vävnad som huvudsakligen består av multikärnorikas myofibrer, som är effektorcellerna för frivilliga rörelser. Den har en anmärkningsvärd förmåga att regenerera, en process som liknar embryonal myogenes och genomgår försämringar i ålder och sjukdom1. Denna slående regenerativa kapacitet hos skelettmuskulaturen beror på muskelstamceller (MuSCs), som också kallas satellitceller på grund av deras placering mellan sarcolemma och den basala laminan i myofibrer2,3. Under viloförhållanden är muscs quiescent och kännetecknas av uttrycket av transkriptionsfaktorn Pax7 och quiescence markörer som Sprouty14,5,6,7,8. Vid aktivering, t.ex. efter skada, lämnar MuSCs det quiescenta tillståndet och uppreglerar den myogena regleringsfaktorn MyoD9. Pax7/MyoD dubbelpositiva MuSCs förökar sig och differentierar därmed myogena prekursorceller, som också ofta kallas myoblaster. Dessa myoblaster skiljer sig sedan ytterligare i långsträckta myocyter, en process som sammanfaller med molekylära och morfologiska förändringar, t.ex. förlust av Pax7 och uppreglering av Myogenin uttryck10. Myocyter smälter sedan så småningom till varandra eller till befintliga myofibrer och reparerar därmed den skadade vävnaden. Viktigt är att en liten del av muskelstamcellerna återställer MyoD-uppregleringen och kan själv förnya11. Statusen för MuSC differentiering och myogen progression kan lätt observeras genom undersökning av myogena markörer såsom Pax7, MyoD och Myogenin10.
Kulturen hos enskilda myofibrer med sina intilliggande MuSCs är en utmärkt metod för att undersöka MuSC-funktionalitet i en ex vivo-miljö eftersom MuSCs finns kvar i sin endogena nisch12,13. Beteendet hos MuSCs regleras av inneboende signaler samt extrinsiska signaler som tillhandahålls av nischen, en specialiserad anatomisk plats som består av komponenter i den extracellulära matrisen (ECM) som omger MuSCs och myofibern själv. Till exempel är en av de extrinsiska regulatorerna för MuSC quiescence Notch-signalering. Här tas signalsignaler emot av MuSCs från både myofiber och ECM14,15,16. Dessutom är MuSC-nischen viktig för att kontrollera uppdelningsaxeln för MuSCs och därmed reglera cellernas öde för MuSC-dottercellerna17,18. Rimligen kan parametrar som asymmetriska MuSC-divisioner, myogen progression och självförnyelse bedömas unikt i denna experimentella installation. Till exempel kan ett multicellulärt kluster bildas från en MuSC efter en 72 h kulturperiod, som kan undersökas för förekomst och procentandel av distinkta myogena populationer som självförnyelse, prolifererande och ytterligare differentierade MuSCs8,19,20,21. Differentieringstillståndet för MuSCs kan bestämmas genom undersökning av uttrycket/meduttrycket av Pax7, MyoD och Myogenin. Efter 72 h av kulturen kan cellerna i ett kluster diskrimineras av följande parametrar: Pax7 endast celler är självförnyande MuSCs, medan Pax7/ MyoD dubbla positiva celler förökar sig / aktiverade MuSCs och ytterligare differentierade myogena celler är Myogenin positiva22. Vidare kan MuSC-nummer eller återinträde i cellcykeln/aktiveringen undersökas utöver myogen progression, t.ex. genom immunofluorescensbaserade analyser baserade på de parametrar som beskrivs ovan.
Här beskrivs de unika egenskaperna hos myofiberisolerings- och kulturprotokollet, t.ex. bevarandet av interaktionen mellan MuSC och dess nisch. Mus hela EDL (extensor digitorum longus) muskler är noggrant dissekerade, smälta av kollagenas, och fysiskt triturerade för att få enstaka myofibers med deras tillhörande MuSCs för ytterligare kultur. Dessutom beskriver protokollet stegen för att transfektera MuSCs med siRNA för funktionella analyser av kandidatgener och på varandra följande immunofluorescensbaserade analyser utan behov av transgena djur.
Här presenteras en metod för att funktionellt undersöka rollen av en specifik gen i MuSCs med hjälp av en in vitro-metod. Viktigt, i det system som beskrivs här odlas muscs under förhållanden, som liknar in vivo-situationen så mycket som möjligt och bevarar de flesta interaktionerna mellan muscs med deras nisch. Detta åstadkoms genom att odla isolerade myofibers med sina intilliggande MuSCs under flytande förhållanden och på varandra följande siRNA-transfection. Förfarandena för myofiber isolering, siRNA transfection och undersökning av MuSC populationer under 72 h av kultur genom immunofluorescens analyser beskrivs. Dessutom visades det att cirka 74% av alla MuSCs transfected med en fluorescerande märkt kontroll siRNA efter 30 h av kultur.
Särskild uppmärksamhet bör fokuseras på noggrann dissekering av EDL muskeln eftersom omfattande stretching, klämning eller klämning kommer att leda till sammandragning och på varandra följande död av myofibers. Dessutom är det viktigt att undersöka kluster av MuSCs från minst 20 olika myofiber per replikat per villkor. Detta är nödvändigt eftersom MuSC-nummer och egenskaper varierar på grund av förekomsten av MuSC-subpopulationer. När man undersöker effekten av ett specifikt siRNA på MuSCs med hjälp av den flytande myofiber kulturmetoden en jämförelse av villkoret med inriktning siRNA till den icke-riktade kontrollen bör utföras inom samma mus och muskel. Detta rekommenderas för att undvika musspecifika skillnader som kan täcka eller förstärka effekterna av siRNA. Knockdown-effektiviteten kan bestämmas av immunofluorescensanalyser med antikroppar riktade mot målgenen med hjälp av enstaka myofibrer med deras intilliggande MuSCs. Om detta inte är ett alternativ kan man testa siRNA knockdown effektivitet i primära myoblaster följt av kvantitativa RT-PCR eller immunoblot analyser. Effektiviteten av siRNA bör bestämmas innan du analyserar effekten av siRNA på MuSCs på enstaka myofibrer. Användningen av en smart pool bestående av 4 olika siRNAs kontra en enda ökar knockdown-effektiviteten men ökar också risken för ospecificerad inriktning. En siRNA som inte är riktad ska användas som en kontroll. För att direkt övervaka transfekteringseffektiviteten kan man använda en fluorescerande märkt icke-mål siRNA som utförs här. Tidspunkten för transfection med siRNA är cirka 4 timmar efter isolering, en tidpunkt då den basala laminan som omger MuSCs redan är genomsläpplig för siRNA. Om effekten av ett specifikt siRNA på MuSCs efter 72 eller 96 h bör undersökas, rekommenderas att utföra en andra siRNA-transfektion efter 24 h eller 48 h för att upprätthålla en hög knockdown effektivitet.
Myofiberkulturens analys visar olika fördelar jämfört med undersökningen av MuSCs med konventionella cellodlingsmetoder. MuSCs förblir knutna till myofibrerna under hela isoleringsprocessen och bevarar därmed den avgörande interaktionen mellan MuSC med sin nisch19,23,24,25. Den bevarade interaktionen mellan MuSCs med myofiber är en förutsättning för att studera nischberoende effekter på MuSC-funktionalitet, som inte kan sammanfattas i konventionella 2D myoblast kulturer. Till exempel, under åldrande MuSCs display nedsatt myogen kapacitet vilket resulterar i en minskad effektivitet för att regenerera muskelvävnad efter skada20,26. Denna nedskrivning är åtminstone delvis hänförlig till förändringar i MuSC-nischen, särskilt förändringar iECM-sammansättningen 27,28. Myofiberkulturprotokollet tillåter studier och interferens med dessa avvikande nischförändringar.
I motsats till den metod som beskrivs här innebär rening av MuSCs genom immunolabeling och -sorteringstekniker som FACS (fluorescensaktiverad cellsortering) eller MACS (magnetisk cellsortering) avlägsnandet av MuSCs från deras nisch. Intressant nog förlorar 2D-kulturer av isolerade MuSCs från åldrade muskler sina extrinsiska signaler och beter sig som MuSCs isolerade från unga muskler och därmed inte rekapitulerar in vivo-situationen på lämpligt sätt29. Dessutom resulterar den fullständiga dissociationen av muskelvävnaden och märkning av muscs med ytmarkörer i transkriptomiska förändringar och aktivering av cellerna30,31,32. En annan fördel med myofiberkultursystemet är möjligheten att störa MuSC-funktionaliteten på olika nivåer. Manipulering av MuSCs på odlade myofibers kan effektivt uppnås genom siRNA-medierad gen knockdown som beskrivs här i detalj. På samma sätt är appliceringen av kemiska föreningar eller leverans av rekombinanta proteiner mycket effektiv för att störa stamcellsvägar20,28. Dessutom tillåter retro- eller lentivirala uttrycksvektorer införandet av exogena gener, dvs. konstituerande aktiva mutanter33. Dessutom kan påverkan av extrinsiska faktorer på MuSC-funktionalitet utforskas i det system som beskrivs här, t.ex. kan odlingsförhållandena kompletteras med supernatant från olika fysiologiska eller patologiska källor för att modellera olika tillstånd som cancercakexi34,35.
En begränsning av metoden som beskrivs här är det faktum att det enda myofiberkultursystemet inte helt kan rekapitulera effekten av alla systemiska faktorer eller påverkan av andra celltyper på MuSCs. Dessutom är den tid då myofibers kan hållas livskraftiga i kultur begränsad och därför fokuserar studien av MuSC-relaterade processer på tidiga händelser som aktivering och myogent engagemang. Dessutom är undersökningen av MuSC-interaktionen med andra nischceller såsom immunceller eller fibroadipogenic stamceller inte möjlig. För att undersöka systemiska effekter på MuSC-funktionalitet kan man antingen utföra muskelskada experiment följt av analys av muskelregenerering in vivo eller utföra transplantationsexperiment36,37.
Sammantaget ger myofiberisolerings- och kulturprotokollet stora möjligheter till genetiska eller mekanistiska studier på vuxna muscs utan krav på transgena musmodeller och kan potentiellt minska djurförsök.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Christine Poser och Christina Picker för utmärkt teknisk hjälp och kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft till JvM (MA-3975/2-1), Carl Zeiss-stiftelsen och Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
horse serum | Gibco | 26050-088 | |
Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |