Vitrifiering av in vitromogna oocyter som samlats in från vuxna och prepubertala äggstockar hos får
Summary
Protokollet syftar till att tillhandahålla en standardmetod för vitrifiering av vuxna och juvenila fåroocyter. Det innehåller alla steg från förberedelsen av in vitro-mognadsmedierna till den eftervärmande kulturen. Oocyter förstoras på MII-stadiet med Cryotop för att säkerställa minsta väsentliga volym.
Abstract
I boskap kan in vitro embryoproduktionssystem utvecklas och upprätthållas tack vare det stora antalet äggstockar och äggceller som lätt kan erhållas från ett slakteri. Vuxna äggstockar bär alltid flera antral folliklar, medan i pre-pubertala givare det maximala antalet äggceller är tillgängliga vid 4 veckors ålder, när äggstockar bär toppantal antral folliklar. Således anses 4 veckor gamla lamm vara bra givare, även om utvecklingskompetensen hos prepubertala äggceller är lägre jämfört med deras vuxna motsvarighet.
Grundforskning och kommersiella tillämpningar skulle ökas av möjligheten att framgångsrikt kryopreservera vitrified oocyter som erhållits från både vuxna och prepubertala givare. Vitrifiering av äggceller som samlats in från prepubertala givare skulle också möjliggöra förkortning av produktionsintervallet och därmed öka den genetiska vinsten i avelsprogram. Förlusten av utvecklingspotential efter kryopreservation gör dock däggdjursoocyter förmodligen en av de svåraste celltyperna att kryopreservera. Bland de tillgängliga kryopreservationsteknikerna tillämpas vitrifiering i stor utsträckning på djur och mänskliga äggceller. Trots de senaste framstegen inom tekniken inducerar exponeringar för höga koncentrationer av kryoprotektiva medel samt kylskada och osmotisk stress fortfarande flera strukturella och molekylära förändringar och minskar utvecklingspotentialen hos däggdjursoocyter. Här beskriver vi ett protokoll för vitrifiering av får oocyter samlas in från juvenil och vuxna givare och mogna in vitro före cryopreservation. Protokollet omfattar alla procedurer från oocyt in vitro mognad till vitrification, uppvärmning och efter uppvärmning inkubationstid. Oocyter som förstoras på MII-stadiet kan verkligen befruktas efter uppvärmning, men de behöver extra tid före befruktning för att återställa skador på grund av kryopreservationsförfaranden och för att öka deras utvecklingspotential. Således är eftervärmning kulturförhållanden och timing avgörande steg för återställande av oocyte utvecklingspotential, särskilt när äggceller samlas in från juvenila givare.
Introduction
Långsiktig lagring av kvinnliga gameter kan erbjuda ett brett spektrum av applikationer, såsom att förbättra inhemsk djuruppfödning genom genetiska urvalsprogram, bidra till att bevara den biologiska mångfalden genom ex-situ wildlife species conservation program, och öka in vitro bioteknik forskning och applikationer tack vare tillgången på lagrade äggceller som ska införlivas i in vitro embryoproduktion eller kärntransplantationsprogram1,2,3. Juvenil oocyte vitrification skulle också öka genetisk vinst genom att förkorta produktionsintervallet i avelsprogram4. Vitrifiering genom ultra-snabb kylning och uppvärmning av äggceller anses för närvarande vara en standardmetod för boskap oocyter cryopreservation5. I idisslare, före vitrifiering, mognas äggceller vanligtvis in vitro, efter hämtning från folliklar som erhållits från slakteri-härledda äggstockar2. Vuxna, och särskilt prepubertalaäggstockar 4,6, kan verkligen leverera ett praktiskt taget obegränsat antal äggceller som ska kryopreserveras.
Hos nötkreatur, efter oocyte vitrification och uppvärmning, blastocyst avkastning på >10% har rapporterats ofta av flera laboratorier under det senaste decenniet3. I små idisslare anses dock oocyte vitrification fortfarande vara relativt ny för både juvenila och vuxna äggceller, och en standardmetod för får oocyte vitrification återstår att upprätta2,5. Trots de senaste framstegen presenterar den förstorade och uppvärmda äggcellen verkligen flera funktionella och strukturella förändringar som begränsar deras utvecklingspotential7,8,9. Således har få artiklar rapporterat blastocyst utveckling på 10% eller mer i vitrified / uppvärmda får oocyter2. Flera tillvägagångssätt har undersökts för att minska de ovan nämnda ändringarna: optimera sammansättningen av vitrifierings- och upptiningslösningarna10,11; experimentera med användning av olika cryo-enheter8,12,13; och tillämpa särskilda behandlingar under in vitro-mognad (IVM)4,14,15 och/eller under återhämtningstiden efter uppvärmning6.
Här beskriver vi ett protokoll för vitrifiering av får oocyter samlas in från juvenil och vuxna givare och mogna in vitro före cryopreservation. Protokollet innehåller alla procedurer från oocyt in vitro mognad till vitrification, uppvärmning och efter uppvärmning kulturperiod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oocyte cryopreservation hos husdjur kan inte bara möjliggöra långsiktigt bevarande av kvinnliga genetiska resurser, men också främja utvecklingen av embryonala bioteknik. Utvecklingen av en standardmetod för oocytevitrifiering skulle således gynna både boskapen och forskningssektorn. I detta protokoll presenteras en komplett metod för vuxna får oocyte vitrification och kan representera en solid utgångspunkt för utvecklingen av ett effektivt vitrification system för juvenil äggceller.
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna fick ingen särskild finansiering för detta arbete. Professor Maria Grazia Cappai och Dr. Valeria Pasciu är tacksamt erkända för videoröstningen och för att ha satt upp labbet under videotillverkningen.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell’Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).
