JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Published: March 19, 2021
doi:
10.3791/62308
,
1Program for Neuroscience and Mental Health,Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics,University of Toronto

Summary

Burada, postnatal fare retinal eksplantlarında nörit morfogenezini hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Membran hedefli floresan proteinlerini Cre’e bağımlı bir şekilde eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs vektörlerini kullanarak retina hücre tiplerinin ve ince süreçlerinin seyrek etiketlenmesi ve edinilmesi için bir yaklaşım tanımladık.

Abstract

Dendritik arborsları modelleyen mekanizmaları keşfetmek, gelişim sırasında dendritleri görselleştirmek, görüntülemek ve analiz etmek için yöntemler gerektirir. Fare retinası, nöronal morfogenez ve bağlantının hücre tipine özgü mekanizmalarının araştırılması için güçlü bir model sistemidir. Retinal alt tiplerin organizasyonu ve bileşimi iyi tanımlanmıştır ve gelişim sırasında belirli tiplere erişmek için genetik araçlar mevcuttur. Birçok retinal hücre tipi ayrıca dendritlerini ve / veya aksonlarını dar tabakalarla sınırlar, bu da hızlandırılmış görüntülemeyi kolaylaştırır. Fare retina eksplant kültürleri, konfokal veya multifoton mikroskopisi kullanarak canlı hücre görüntüleme için çok uygundur, ancak dendrit dinamiklerini zamansal ve yapısal çözünürlükle görüntülemek için optimize edilmiş yöntemler eksiktir. Burada Cre-Lox sistemi tarafından işaretlenmiş spesifik retinal popülasyonların gelişimini seyrek olarak etiketlemek ve görüntülemek için bir yöntem sunulmaktadır. Burada kullanılan ticari olarak temin edilebilen adeno ilişkili virüsler (AAV’ler), membran hedefli floresan proteinlerini Cre’ye bağımlı bir şekilde ifade etti. Yenidoğan farelerde AAV’lerin göz içi doğumu, enjeksiyondan 4-5 gün sonra (dpi) hedeflenen hücre tiplerinin floresan etiketlemesini sağlar. Membran floresan sinyalleri konfokal görüntüleme ile algılanabilir ve ince dal yapılarını ve dinamiklerini çözer. 2-4 saate yayılan yüksek kaliteli videolar, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile perfüze edilmiş görüntüleme retinal düz montajlarından elde edilir. Ayrıca, dekonvolüsyon ve üç boyutlu (3B) sapma düzeltmesi için bir görüntü son işleme ardışık düzenidir. Bu protokol, sağlam retinadaki çeşitli hücresel davranışları yakalamak ve nörit morfogenezini kontrol eden yeni faktörleri tanımlamak için kullanılabilir. Retinada öğrenilen birçok gelişimsel strateji, merkezi sinir sisteminin başka yerlerinde nöral devrelerin oluşumunu anlamak için geçerli olacaktır.

Introduction

Retinal nöronların dendritleri, nöral devreler içindeki işlevlerini etkileyen karmaşık, ancak spesifik kalıplar oluşturur. Omurgalı retinasında, çeşitli tipte retinal ganglion hücreleri (RGC’ler) ve amakrin hücre internöronları, ağaç dikme boyutu, yeri, dal uzunluğu ve yoğunluğu bakımından farklılık gösteren benzersiz dendritik morfolojiler taşır1. Postnatal gelişim sırasında, RGC’ler ve amakrin hücreler, coşkulu dendritik süreçleri, fotoreseptör sinyallerini ileten bipolar hücre girdilerini aldıkları iç pleksiform tabaka (IPL) adı verilen bir nöropil içine genişletirler2. Civciv veya zebra balığı larvalarında floresan olarak etiketlenmiş retinal popülasyonların hızlandırılmış görüntülenmesiyle yakalandığı gibi, dendrit morfogenezi oldukça dinamiktir3,4,5. Birkaç gün içinde, dendritik arborslar IPL’nin dar alt katmanlarına genişler, yeniden şekillenir ve yükselir, burada seçkin ortaklarla sinaps yaparlar. Arbors, gelişim üzerinde farklı yapısal dinamikler sergiler ve göreceli dal ilavesi, geri çekme ve stabilizasyon oranlarındaki değişikliklerle birlikte. Amakrin ve RGC dendritleri ayrıca tipe özgü ağaçlandırmayı yansıtabilecek farklı büyüme ve yeniden şekillendirme davranışları sergiler. Bununla birlikte, bu çalışmalar geniş amakrin veya RGC popülasyonlarını izlemiş ve morfolojinin sadece bir yönü olan laminer hedeflemeye odaklanmıştır.

Retinal alt tiplerde gözlenen geniş morfolojik çeşitliliği üreten mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu grubun amacı, farelerde tanımlanmış retinal alt tiplerin dendrit dinamiklerini ve arbor yeniden şekillenmesini yakalamak için bir yöntem geliştirmekti. Dendrit desenlemesinin hücre tipine özgü mekanizmalarını tanımlamak, ilgilenilen hücrelerin dendrit davranışlarını görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler gerektirir. Fare retinalarının organotipik kültürleri, konfokal veya multifoton mikroskopi kullanan canlı hücre görüntüleme çalışmaları için çok uygundur. Gelişmekte olan retinalar diseke edilir ve bir kayıt odasında birkaç saat boyunca görüntülenebilen veya devre üzerinde sınırlı etkilerle birkaç gün boyunca kültürlenebilen düz bir eksplanta monte edilir6,7. Canlı retinal nöronlar, elektrotlarla boya doldurma, elektroporasyon, lipofilik boyalarla kaplanmış parçacıkların biyolistik iletimi veya floresan proteinleri kodlayan plazmidler (örneğin, Gen Tabancası) ve genetik olarak kodlanmış hücre etiketleri7,8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli tekniklerle etiketlenebilir7,8,9,10 . Bununla birlikte, bu yaklaşımlar spesifik retinal alt tiplerin dendrit dinamiklerini görüntülemede verimsizdir. Örneğin, boya doldurma yöntemleri düşük verimlidir ve ilgilenilen hücreleri güvenilir bir şekilde hedeflemek için elektrofizyoloji aparatı ve ek genetik etiketler gerektirir. Dahası, somadaki güçlü floresan sinyalleri yakındaki dendritleri gizleyebilir.

Biyolistik gen verme yöntemleri aynı anda düzinelerce hücreyi etiketleyebilir, ancak yüksek basınçlı parçacık dağıtımını ve izole retinanın gece boyunca inkübasyonunu içeren adımlar hücre fizyolojisini ve dendritik büyümeyi tehlikeye atabilir. Bu makale, aşağıdaki deneysel kriterler göz önüne alındığında, hücre tipi ve yapısal çözünürlük ile erken dendrit dinamiklerini yakalamak için son genetik araçların kullanılabileceğini önermektedir. İlk olarak, gelişmekte olan arborslara hakim olan ince dalları ve filopodia’yı çözmek için, yöntem nöronları tüm çardaktaki süreçleri dolduran parlak, floresan proteinlerle etiketlemelidir. Görüntüleme süresi boyunca fotobeyazlatma nedeniyle floresan etiketleme solmamalıdır. Çeşitli floresan protein varyantları üretilmiş ve parlaklık ve fotostabiliteye dayalı olarak in vivo/ex vivo görüntülemeye11 uygunluk açısından karşılaştırılmıştır. İkincisi, floresan proteinler (XFP’ler), dendrit morfogenezinin en erken aşaması ile yeterince yüksek seviyelerde eksprese edilmelidir, böylece dar gelişim penceresi kaçırılmaz. Fare retinasındaki statik zaman noktalarının analizlerinde, dendrit gelişimi doğum sonrası ilk haftada meydana gelir ve büyüme, yeniden modelleme ve stabilizasyon aşamalarını içerir10,12,13,14,15. Üçüncüsü, yöntem seçici etiketlemeye veya ilgilenilen nöronal alt popülasyonun etiketlenme olasılığının artmasına yol açmalıdır. Dördüncüsü, hedef alt popülasyonun etiketlenmesi yeterince seyrek olmalıdır, böylece tüm nöronal ağaç dikme tanımlanabilir ve izlenebilir. RGC ve amakrin alt tipleri olgun morfolojik özellikleri ve IPL tabakalaşma paternleri16,17,18,19,20 ile ayırt edilebilse de, zorluk, olgunlaşmamış yapılara dayanarak gelişim sırasında alt tipleri tanımlamaktır. Bu görev, geliştirme sırasında spesifik retinal hücre tiplerini etiketlemek için transgenik araçların genişletilmesiyle kolaylaştırılmıştır.

Floresan proteinlerin veya Cre’nin hücresel ve zamansal ekspresyonunun gen düzenleyici elementler tarafından belirlendiği transgenik ve knock-in fare çizgileri, retinal hücre tiplerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır13,21,22,23. Dendrit gelişiminin alt tipe özgü kalıpları üzerine yapılan temel gözlemler, statik zaman noktalarında transgenik fare retinaları üzerine yapılan çalışmalardan gelmiştir10,14,24,25. Özellikle Cre-Lox sistemi, çeşitli rekombinaze bağımlı muhabirler, sensörler ve optogenetik aktivatörler kullanarak alt tiplerin mükemmel gen manipülasyonunu ve izlenmesini sağlar. Bu araçlar, retinal devre düzeneğinin altında yatan alt tipe özgü moleküler programların ve fonksiyonel özelliklerin keşfedilmesine yol açmıştır26,27,28,29,30. Bununla birlikte, fare retinasındaki alt tipe özgü dendrit dinamiklerini incelemek için henüz kullanılmamışlardır. Düşük yoğunluklu etiketleme, Cre fare çizgilerinin elektroporasyon veya rekombinant AAV’ler tarafından tanıtılan transgenlerle birleştirilmesiyle elde edilebilir. Varsa, tamoksifen ile indüklenebilir Cre hatları veya kesişimsel genetik stratejiler de kullanılabilir. Son olarak, hücre minimal invaziv bir şekilde etiketlenmeli ve dokudan ödün vermemek veya dendrit morfogenezi için gerekli hücresel fonksiyona müdahale etmemek için edinim parametreleri kullanılarak görüntülenmelidir.

Burada canlı fare retinal eksplantlarında dendrit dinamiklerini araştırmak için transgenik araçlar ve konfokal mikroskopi uygulamak için bir yöntem sunulmaktadır. Cre transgenik fare çizgileri, Cre rekombinasyonu üzerine floresan proteinleri eksprese eden AAV vektörleri ile birleştirilmiştir, bu da ilgilenilen retinal hücrelerin seyrek etiketlenmesine izin verir. Ticari olarak temin edilebilen AAV’ler intravitreal enjeksiyonlarla yenidoğan retinasına verilir. Bu makale, AAV’lerin 4 dpi ile önemli ölçüde yüksek ve hücre tipine özgü floresan ekspresyonu ürettiğini ve doğum sonrası zaman noktalarına erişime izin verdiğini göstermektedir. Bu yaklaşımı göstermek için, kolinerjik “starburst” amakrin internöron, yenidoğan farelerde kolin asetiltransferaz (ChAT)-internal ribozom giriş bölgesi (IRES)-Pre transgenini eksprese eden Brainbow AAV verilerek etiketlendi31,32. Starburst amakrin hücreleri, kümelenmiş protokadherinlerin aracılık ettiği dendrit kendinden kaçınma ile şekillenen stereotipli ve radyal bir ağaç dikme morfolojisi geliştirir33,34. Bu makale, yıldız patlaması dendritlerinin ve filopodia’nın çözünürlüğünün, Brainbow AAV’ler için kullanıldığı gibi, farzesilasyona uğrayan CAAX motifinin eklenmesiyle XFP’ler tarafından plazma zarına önemli ölçüde iyileştirildiğini göstermektedir31. Son olarak, dendrit rekonstrüksiyonu ve morfometrik niceleme için uygun yüksek kaliteli görüntüler üreten hızlandırılmış görüntüleme ve işlem sonrası protokoller belirlenmiştir. Bu protokol, dendrit morfogenezini kontrol eden faktörleri tanımlamak ve sağlam retinadaki çeşitli hücresel davranışları yakalamak için kullanılabilir.

Protocol

NOT: Bu protokol, deney günleri arasında viral transdüksiyon için minimum 4-5 günlük bir süre ile 2 güne yayılmaktadır (Şekil 1A). Hayvan deneyleri, Kanada Hasta Çocuklar Hastanesi (Toronto, Kanada) Hayvan Hizmetleri Laboratuvarı Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında Araştırma ve Laboratuvar Hayvan Bakımında Hayvanların Kullanımı için Hayvan Bakım Kılavuzları Konseyi’ne uygun olarak gerçekleştirilir. <p class="jove_t…

Representative Results

Yukarıdaki protokolü kullanarak, yıldız patlaması hücresi dendritlerinin geliştirilmesinin yüksek çözünürlüklü bir 3D videosu elde edildi, deconvolved edildi ve 3D sürüklenme için düzeltildi. Analiz için 2D videolar yapmak üzere Z-düzlemi maksimum projeksiyonları üretildi (Ek Video 1, Şekil 5A). Her zaman noktasının 3D dekonvolüsyonu, ince filopodia projeksiyonlarının çözünürlüğünü arttırmıştır (Şekil 5B…

Discussion

Bu video, gelişmekte olan retinal nöronların dendrit dinamiklerini konfokal canlı görüntüleme ile görüntülemek için mevcut genetik araçları kullanan deneysel bir boru hattını göstermektedir. Ayrıca, membran hedefli floresan proteinlerini yenidoğan farelere kodlayan Cre-bağımlı AAV’lerin göz içi enjeksiyonları da gösterilmiştir. Genetik olarak hedeflenmiş popülasyonların tek hücreleri, 4-5 dpi kadar erken bir sürede parlak bir şekilde etiketlenir. Standart görüntüleme odalarının canlı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Madison Gray’e, hiç sahip olmadığım zamanlarda bana yardım ettiği için teşekkür ederiz. Bu araştırma bir NSERC Keşif Bursu (RGPIN-2016-06128), Nörobilimde bir Sloan Bursu ve bir Kanada Araştırma Başkanı Tier 2 (J.L.L.’ye) tarafından desteklenmiştir. S. Ing-Esteves, Görme Bilimleri Araştırma Programı ve NSERC Yüksek Lisans Bursları-Doktora tarafından desteklenmiştir.

Materials

Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paper Whatman 1001-070
Dumont #5 fine forceps FST 11252-20 Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection
Dumont forceps VWR 82027-426
Fine Scissors FST 14058-09
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size Millipore HABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mm VWR 470313-352
Polyethylene disposable transfer pipette VWR 470225-034
Round tip paint brush, size 3/0 Conventional art supply store Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting
Surgical Scissors FST 14007-14
Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge FST 15000-08
Live-imaging incubation system
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' Warner Instruments 64-0755
Dual channel heater controller, Model TC-344C Warner Instruments 64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective Leica 15506374
Heater controller cable Warner Instruments CC-28
Large bath incubation chamber with slice support Warner Instruments RC-27L
MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 70-2027
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) Warner Instruments PM-6D
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 55-4148
Sample anchor (Harps) Warner Instruments 64-0260 Sample anchor must be compatible with incubation chamber
Sloflo In-line Solution Heater Warner Instruments SF-28
Neonatal Injections
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle Hamilton Company 80314
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) BD PrecisionGlide 305106
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)  WPI World Precision Instruments TW100-4
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) Sigma-Aldrich V001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF Penn Vector Core AV-9-PV2453 Addgene Plasmid #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF		 Penn Vector Core AV-9-PV2454 Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line The Jackson Laboratory 6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 % Sigma-Aldrich F7252-25G
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 Sutter Instrument Co. P-97
Green tattoo paste Ketchum MFG Co 329A
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich 806552
Pneumatic PicoPump WPI World Precision Instruments PV-820
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2) AirGas X02OX95C2003102 Supplier may vary depending on region
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES, Free Acid Bio Basic HB0264
Hydrochloric acid solution, 1 N Sigma-Aldrich H9892
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670
pH-Test strips (6.0-7.7) VWR BDH35317.604
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Sodium chloride (NaCl) Bio Basic DB0483
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich RDD007
Software
ImageJ National Institutes of Health (NIH) Open source
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
  2. Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synaptic specificity and retinal circuit formation. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental biology. 10 (1), 379 (2021).
  3. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  4. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
  5. Wong, W. T., Faulkner-Jones, B. E., Sanes, J. R., Wong, R. O. Rapid dendritic remodeling in the developing retina: dependence on neurotransmission and reciprocal regulation by Rac and Rho. The Journal of Neuroscience. 20 (13), 5024-5036 (2000).
  6. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nature Protocols. 5 (7), 1347-1352 (2010).
  7. Morgan, J. L., Wong, R. O. L. Ballistic labeling with fluorescent dyes and indicators. Current Protocols in Neuroscience. 43 (1), 1-10 (2008).
  8. Nickerson, P. E. B., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Developmental Biology. 13, 24 (2013).
  9. Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. L. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
  10. Coombs, J. L., Van Der List, D., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells during postnatal development. The Journal of Comparative Neurology. 503 (6), 803-814 (2007).
  11. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  12. Stacy, R. C., Wong, R. O. L. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 456 (2), 154-166 (2003).
  13. Kay, J. N., et al. Retinal ganglion cells with distinct directional preferences differ in molecular identity, structure, and central projections. The Journal of Neuroscience. 31 (21), 7753-7762 (2011).
  14. Liu, J., Sanes, J. R. Cellular and molecular analysis of dendritic morphogenesis in a retinal cell type that senses color contrast and ventral motion. The Journal of Neuroscience. 37 (50), 12247-12262 (2017).
  15. Diao, L., Sun, W., Deng, Q., He, S. Development of the mouse retina: emerging morphological diversity of the ganglion cells. Journal of Neurobiology. 61 (2), 236-249 (2004).
  16. Coombs, J., vander List, D., Wang, G. Y., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells. Neuroscience. 140 (1), 123-136 (2006).
  17. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  18. Sümbül, U., et al. A genetic and computational approach to structurally classify neuronal types. Nature Communications. 5, 3512 (2014).
  19. Lin, B., Masland, R. H. Populations of wide-field amacrine cells in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 499 (5), 797-809 (2006).
  20. Macneil, M. A., Heussy, J. K., Dacheux, R. F., Raviola, E., Masland, R. H. The shapes and numbers of amacrine cells: Matching of photofilled with Golgi-stained cells in the rabbit retina and comparison with other mammalian species. Journal of Comparative Neurology. 413 (2), 305-326 (1999).
  21. Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
  22. Jo, A., Xu, J., Deniz, S., Cherian, S., DeVries, S. H., Zhu, Y. Intersectional strategies for targeting amacrine and ganglion cell types in the mouse retina. Frontiers in Neural Circuits. 12, 66 (2018).
  23. Siegert, S., et al. Genetic address book for retinal cell types. Nature Neuroscience. 12 (9), 1197-1204 (2009).
  24. Kim, I. -. J., Zhang, Y., Meister, M., Sanes, J. R. Laminar restriction of retinal ganglion cell dendrites and axons: subtype-specific developmental patterns revealed with transgenic markers. The Journal of Neuroscience. 30 (4), 1452-1462 (2010).
  25. Peng, Y. -. R., Tran, N. M., Krishnaswamy, A., Kostadinov, D., Martersteck, E. M., Sanes, J. R. Satb1 regulates contactin 5 to pattern dendrites of a mammalian retinal ganglion cell. Neuron. 95 (4), 869-883 (2017).
  26. Duan, X., Krishnaswamy, A., Dela Huerta, I., Sanes, J. R. Type II cadherins guide assembly of a direction-selective retinal circuit. Cell. 158 (4), 793-807 (2014).
  27. Ray, T. A., et al. Formation of retinal direction-selective circuitry initiated by starburst amacrine cell homotypic contact. eLife. 7, 34241 (2018).
  28. Krishnaswamy, A., Yamagata, M., Duan, X., Hong, Y. K., Sanes, J. R. Sidekick 2 directs formation of a retinal circuit that detects differential motion. Nature. 524 (7566), 466-470 (2015).
  29. Caval-Holme, F., Zhang, Y., Feller, M. B. Gap junction coupling shapes the encoding of light in the developing retina. Current Biology. 29 (23), 4024-4035 (2019).
  30. Lucas, J. A., Schmidt, T. M. Cellular properties of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells during postnatal development. Neural Development. 14 (1), 8 (2019).
  31. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. 10 (6), 540-547 (2013).
  32. Rossi, J., et al. Melanocortin-4 receptors expressed by cholinergic neurons regulate energy balance and glucose homeostasis. Cell Metabolism. 13 (2), 195-204 (2011).
  33. Lefebvre, J. L., Kostadinov, D., Chen, W. V., Maniatis, T., Sanes, J. R. Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous system. Nature. 488 (7412), 517-521 (2012).
  34. Ing-Esteves, S., et al. Combinatorial effects of alpha- and gamma-protocadherins on neuronal survival and dendritic self-avoidance. The Journal of Neuroscience. 38 (11), 2713-2729 (2018).
  35. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. L. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (1), (2013).
  36. Ramoa, A. S., Campbell, G., Shatz, C. J. Transient morphological features of identified ganglion cells in living fetal and neonatal retina. Science. 237 (4814), 522-525 (1987).
  37. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  38. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
  39. Cuntz, H., Forstner, F., Borst, A., Häusser, M. One rule to grow them all: a general theory of neuronal branching and its practical application. PLoS Computational Biology. 6 (8), 1000877 (2010).
  40. Xiao, H., Peng, H. APP2: automatic tracing of 3D neuron morphology based on hierarchical pruning of a gray-weighted image distance-tree. Bioinformatics. 29 (11), 1448-1454 (2013).
  41. Nanda, S., et al. Design and implementation of multi-signal and time-varying neural reconstructions. Scientific data. 5, 170207 (2018).
  42. Sherry, D. M., Wang, M. M., Bates, J., Frishman, L. J. Expression of vesicular glutamate transporter 1 in the mouse retina reveals temporal ordering in development of rod vs. cone and ON vs. OFF circuits. The Journal of Comparative Neurology. 465 (4), 480-498 (2003).
  43. Johnson, J., et al. Vesicular neurotransmitter transporter expression in developing postnatal rodent retina: GABA and glycine precede glutamate. The Journal of Neuroscience. 23 (2), 518-529 (2003).
  44. Jüttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
  45. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  46. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (31), e1333 (2009).
  47. Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e190 (2007).
  48. Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. The Journal of Comparative Neurology. 476 (3), 254-266 (2004).
  49. Huckfeldt, R. M., et al. Transient neurites of retinal horizontal cells exhibit columnar tiling via homotypic interactions. Nature Neuroscience. 12 (1), 35-43 (2009).
  50. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779 (2020).

Tags

Time-lapse ImagingNeuronal ArborizationSparse Adeno-associated VirusGenetically Targeted Retinal Cell PopulationsSingle-cell LabelingDendritic ArborAxonal ArborNeuronal MorphogenesisConfocal Live ImagingNeonatal Arbor MorphologiesCentral Nervous SystemCre Mouse LineRecombinase-dependent AAVFluorescent ProteinsPlasma MembraneAAV DilutionFast Green FCF DyeNeonatal MiceCorneaIntravitreal SpaceRetinal ACSFCarbogen
check_url/62308?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ing-Esteves, S., Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (169), e62308, doi:10.3791/62308 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image