遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング
Summary
ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。
Abstract
樹状樹木をパターン化するメカニズムを発見するには、開発中に樹状突起を視覚化、画像化、解析する方法が必要です。マウス網膜は、ニューロンの形態形成および接続性の細胞型特異的メカニズムの調査のための強力なモデルシステムである。網膜サブタイプの組織と構成は明確に定義されており、遺伝的ツールは開発中に特定のタイプにアクセスするために利用可能です。多くの網膜細胞タイプはまた、樹状突起および/または軸索を狭い層に拘束し、タイムラプスイメージングを容易にする。マウス網膜外植体培養は、共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を用いた生細胞イメージングには適しているが、樹状突起ダイナミクスを時間的および構造的分解能でイメージングするために最適化された方法は欠けている。ここで提示されるのは、Cre-Loxシステムによってマークされた特定の網膜集団の発達をまばらに標識し、画像化する方法です。ここで用いた市販のアデノ随伴ウイルス(AAV)は、膜標的蛍光タンパク質をCre依存的に発現させた。新生児マウスにおけるAAVの眼内送達は、注射後4〜5日(dpi)までに標的細胞型の蛍光標識を生じる。膜蛍光シグナルは共焦点イメージングによって検出可能であり、微細な分岐構造およびダイナミクスを分解する。2~4時間にわたる高品質のビデオは、酸素化人工脳脊髄液(aCSF)を灌流した画像網膜フラットマウントから取得されます。また、デコンボリューションと3次元(3D)ドリフト補正のための画像後処理パイプラインも提供されます。このプロトコルは、無傷の網膜におけるいくつかの細胞挙動を捕捉し、神経突起形態形成を制御する新規因子を同定するために使用することができる。網膜で学んだ多くの発達戦略は、中枢神経系の他の場所にある神経回路の形成を理解するのに適切であろう。
Introduction
網膜ニューロンの樹状突起は、神経回路内での機能に影響を与える複雑でありながら特異的なパターンを形成する。脊椎動物の網膜では、多様なタイプの網膜神経節細胞(RGC)とアマクリン細胞介在ニューロンが、樹木の大きさ、位置、枝長、密度が異なる独自の樹状突起形態を持っています1。出生後の発達中、RGCとアマクリン細胞は、熱狂的な樹状突起を内側プレキシフォーム層(IPL)と呼ばれるニューロピルに拡張し、そこでバイポーラ細胞入力を受け取り、光受容体シグナルを伝達します2。ヒナまたはゼブラフィッシュの幼虫における蛍光標識網膜集団のタイムラプス画像化によってキャプチャされるように、樹状突起形態形成は非常に動的である3,4,5。数日のうちに、樹状樹木はIPLの狭いサブレイヤーに拡大、改造、および影響し、そこで選択されたパートナーとシナプスします。樹木は、枝の追加、後退、および安定化の相対的な速度の変化を伴う、発達にわたって異なる構造ダイナミクスを示す。アマクリンおよびRGC樹状突起はまた、タイプ特異的樹木化を反映する可能性のある異なる外生およびリモデリング挙動を示す。しかし、これらの研究は、広範なアマクリンまたはRGC集団を追跡し、形態学の1つの側面にすぎない層状標的化に焦点を当てた。
網膜サブタイプ全体で観察された広大な形態学的多様性を生み出すメカニズムは、ほとんど理解されていない。このグループの目的は、マウスにおける定義された網膜サブタイプの樹状突起ダイナミクスおよび樹木リモデリングを捕捉する方法を開発することであった。樹状突起パターニングの細胞型特異的メカニズムを同定するには、目的の細胞の樹状突起挙動を視覚化および測定する方法が必要である。マウス網膜の有機型培養は、共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を用いた生細胞イメージング研究によく適している。発達中の網膜は解剖され、平坦な外植体に装着され、記録チャンバーで数時間画像化することも、回路への影響が限定的な状態で数日間にわたって培養することもできます6,7。生きた網膜ニューロンは、電極による色素充填、エレクトロポレーション、親油性色素でコーティングされた粒子のバイオリスト送達、蛍光タンパク質をコードするプラスミド(例えば、Gene Gun)、ならびに遺伝的にコードされた細胞標識7、8、9、10を含む様々な技術によって標識することができる7、8、9、10.しかし、これらのアプローチは、特定の網膜サブタイプの樹状突起ダイナミクスを画像化するのに非効率的である。例えば、色素充填法はスループットが低く、目的の細胞を確実に標的とするために電気生理学装置と追加の遺伝子標識が必要です。さらに、ソーマの強い蛍光シグナルは、近くの樹状突起を不明瞭にする可能性があります。
バイオリスティック遺伝子送達法は、数十個の細胞を同時に標識することができるが、高圧粒子送達および単離された網膜の一晩インキュベーションを含むステップは、細胞生理機能および樹状突起伸長を損なう可能性がある。本稿では、以下の実験基準により、初期の樹状突起ダイナミクスを細胞型と構造分解能で捉えるために、最近の遺伝的ツールを利用できることを提案している。まず、発達中の樹木園を支配する微細な枝および糸状体を解くために、この方法は、樹木全体のプロセスを満たす明るく蛍光タンパク質でニューロンを標識すべきである。蛍光標識は、イメージング期間中のフォトブリーチングのために退色してはならない。様々な蛍光タンパク質変異体が生成され、輝度と光安定性に基づいて、in vivo/ex vivoイメージング11への適合性について比較されています。第二に、蛍光タンパク質(XFP)は、狭い発生窓が見逃されないように、樹状突起形態形成の初期段階によって十分に高いレベルで発現されなければならない。マウス網膜の静的な時点の分析では、樹状突起の発生は出生後最初の週に起こり、外生、リモデリング、および安定化の段階を含む10,12,13,14,15。第3に、この方法は、選択的標識、または関心のあるニューロン亜集団の標識化の確率の増加につながるはずである。第四に、標的亜集団の標識は、ニューロンアーバー全体を同定および追跡できるように、十分に疎でなければならない。RGCおよびアマクリンサブタイプは、成熟した形態学的特徴およびIPL層別化パターン16,17,18,19,20によって区別することができるが、課題は未成熟構造に基づいて開発中にサブタイプを同定することである。この作業は、発生中に特定の網膜細胞型を標識するためのトランスジェニックツールの拡大によって促進される。
蛍光タンパク質またはCreの細胞的および時間的発現が遺伝子調節要素によって決定されるトランスジェニックおよびノックインマウス系統は、網膜細胞型を研究するために広く使用されている13,21,22,23。樹状突起発生のサブタイプ特異的パターンに関する主要な観察は、静的な時点におけるトランスジェニックマウス網膜の研究から来ている10,14,24,25。特にCre-Loxシステムは、さまざまなリコンビナーゼ依存性レポーター、センサー、および光遺伝学的アクチベーターを使用して、サブタイプの絶妙な遺伝子操作およびモニタリングを可能にします。これらのツールは、網膜回路アセンブリの根底にあるサブタイプ特異的分子プログラムと機能特性の発見をもたらしました26,27,28,29,30。しかし、マウス網膜におけるサブタイプ特異的樹状突起ダイナミクスの研究にはまだ活用されていない。低密度標識は、Creマウス系統とエレクトロポレーションまたは組換えAAVによって導入された導入遺伝子を組み合わせることによって達成することができる。利用可能な場合、タモキシフェン誘導性クレラインまたは交差遺伝子戦略も使用することができる。最後に、細胞は低侵襲の方法で標識され、組織を損なわないように、または樹状突起形態形成に必要な細胞機能を妨げないように、取得パラメータを使用して画像化されるべきである。
ここでは、生きたマウス網膜外植体における樹状突起ダイナミクスを調べるために、トランスジェニックツールおよび共焦点顕微鏡法を適用する方法を提示する。Creトランスジェニックマウス系統は、Cre組換え時に蛍光タンパク質を発現するAAVベクターと組み合わされており、これにより、目的の網膜細胞のまばらな標識が可能になる。市販のAAVは硝子体内注射によって新生児網膜に送達される。この論文は、AAVが4dpiで有意に高い細胞型特異的蛍光発現を産生し、出生後の時点へのアクセスを可能にすることを実証する。このアプローチを説明するために、コリン作動性「スターバースト」アマクリンインターニューロンを、出生後早期網膜で活性であるコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)-内部リボソーム侵入部位(IRES)-Cre導入遺伝子を発現する新生児マウスにおいてBrainbow AAVを送達することによって標識した31,32。スターバーストアマクリン細胞は、クラスター化されたプロトカドヘリンによって媒介される樹状突起自己回避によって形作られたステレオタイプ化された放射状のアーバー形態を発達させる33,34。本論文は、Brainbow AAVs31に用いられているように、ファルネシル化を受けるCAAXモチーフを添加することにより、原形質膜にXFPsによってスターバースト樹状突起と糸状体形成の分解能が有意に向上することを示している。最後に、デンドライト再構成および形態測定定量化に適した高品質の画像を生成するタイムラプスイメージングおよび後処理プロトコルが決定された。このプロトコルは、樹状突起の形態形成を制御する因子を同定し、無傷の網膜におけるいくつかの細胞挙動を捕捉するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このビデオは、既存の遺伝的ツールを利用して、共焦点ライブイメージングで網膜ニューロンを発達させる樹状突起ダイナミクスを画像化する実験パイプラインを示しています。また、膜標的蛍光タンパク質をコードするCre依存性AAVの新生児マウスへの眼内注射も実証されている。遺伝的に標的化された集団の単一細胞は、早くも4〜5dpiと明るく標識されている。網膜フラットマウントは、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マディソン・グレイが、私が何も持っていなかったときに手を差し伸べてくれたことに感謝します。この研究は、NSERCディスカバリーグラント(RGPIN-2016-06128)、神経科学のスローンフェローシップ、カナダ研究委員長ティア2(J.L.L.)の支援を受けました。S. Ing-Estevesは、Vision Science Research ProgramとNSERC Postgraduate Scholarships-Doctoralの支援を受けました。
Materials
| Addgene viral prep #45185-AAV9 | |||
| Addgene viral prep #45186-AAV9 | |||
| Dissection tools | |||
| Cellulose filter paper | Whatman | 1001-070 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11252-20 | Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection |
| Dumont forceps | VWR | 82027-426 | |
| Fine Scissors | FST | 14058-09 | |
| Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size | Millipore | HABG01 300 | |
| Petri Dish, 50 × 15 mm | VWR | 470313-352 | |
| Polyethylene disposable transfer pipette | VWR | 470225-034 | |
| Round tip paint brush, size 3/0 | Conventional art supply store | Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting | |
| Surgical Scissors | FST | 14007-14 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Live-imaging incubation system | |||
| Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' | Warner Instruments | 64-0755 | |
| Dual channel heater controller, Model TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
| HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective | Leica | 15506374 | |
| Heater controller cable | Warner Instruments | CC-28 | |
| Large bath incubation chamber with slice support | Warner Instruments | RC-27L | |
| MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) | Warner Instruments | PM-6D | |
| Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
| Sample anchor (Harps) | Warner Instruments | 64-0260 | Sample anchor must be compatible with incubation chamber |
| Sloflo In-line Solution Heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Neonatal Injections | |||
| 10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle | Hamilton Company | 80314 | |
| 30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| 4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm) | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
| Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) | Sigma-Aldrich | V001229 | |
| AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene Plasmid #45185 |
| AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF |
Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene Plasmid #45186 |
| ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line | The Jackson Laboratory | 6410 | |
| Fast Green FCF Dye content ≥85 % | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Green tattoo paste | Ketchum MFG Co | 329A | |
| Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Pneumatic PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820 | |
| Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents | |||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Carbogen (5% CO2, 95% O2) | AirGas | X02OX95C2003102 | Supplier may vary depending on region |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES, Free Acid | Bio Basic | HB0264 | |
| Hydrochloric acid solution, 1 N | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pH-Test strips (6.0-7.7) | VWR | BDH35317.604 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Software | |||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Open source |
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