עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות
Summary
במאמר זה אנו מתארים את ההליכים שפותחו במעבדה שלנו להכנת אבקות של גבישי מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים במיקרו-גבישים (MicroED).
Abstract
מתואר פרוטוקול מפורט להכנת דגימות מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים (MicroED). MicroED פותחה כדי לפתור מבנים של חלבונים ומולקולות קטנות באמצעות ציוד קריו-מיקרוסקופיית אלקטרונים סטנדרטית (cryo-EM). בדרך זו, מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים מסיסים וחלבוני ממברנה נקבעו לאחרונה לרזולוציות גבוהות. פרוטוקולים מוצגים כאן להכנת רשתות של תרופות מולקולות קטנות באמצעות התרופה carbamazepine כדוגמה. מוצגים פרוטוקולים לסינון ואיסוף נתונים. שלבים נוספים בתהליך הכולל, כגון שילוב נתונים, קביעת מבנה וחידוד מוצגים במקום אחר. הזמן הדרוש להכנת רשתות המולקולות הקטנות מוערך בפחות מ-30 דקות.
Introduction
עקיפה אלקטרונית מיקרוקריסטלית (MicroED) היא שיטת קריו-מיקרוסקופיית אלקטרונים (cryo-EM) לקביעת מבני רזולוציה אטומית מגבישים בגודל תת-מיקרומטרי 1,2. גבישים מיושמים על רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת סטנדרטיות (TEM) ומוקפאים על ידי צלילה לתוך אתאן נוזלי או חנקן נוזלי. לאחר מכן נטענות רשתות לתוך TEM הפועל בטמפרטורות קריוגניות. הגבישים ממוקמים על הרשת ומוקרנים לאיכות עקיפה ראשונית. סיבוב רציף נתוני MicroED נאספים מתת-קבוצה של הגבישים המוקרנים, כאשר הנתונים נשמרים באמצעות מצלמה מהירה כסרט3. סרטים אלה מומרים לפורמט קריסטלוגרפי סטנדרטי ומעובדים באופן כמעט זהה לניסוי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן4.
MicroED פותחה במקור כדי לחקור מיקרו-גבישים חלבוניים 1,2. צוואר בקבוק בקריסטלוגרפיה של חלבונים הוא גידול גבישים גדולים ומסודרים היטב עבור ניסויי עקיפה מסורתיים של קרני רנטגן סינכרוטרון. מכיוון שאלקטרונים מתקשרים עם חומר בסדרי גודל חזקים יותר מקרני רנטגן, מגבלות גודל הגביש הדרושות ליצירת עקיפה ניתנת לגילוי קטנות בהרבה5. בנוסף, היחס בין אירועי פיזור אלסטיים לבלתי אלסטיים הוא חיובי יותר עבור אלקטרונים, מה שמרמז על כך שניתן לאסוף נתונים שימושיים יותר עם חשיפה כוללת קטנה יותר5. התפתחויות בלתי פוסקות אפשרו איסוף נתוני MicroED מהמיקרו-גבישים המאתגרים ביותר 6,7,8,9.
לאחרונה, MicroED הוכח ככלי רב עוצמה לקביעת המבנים של תרופות מולקולות קטנות מחומרים אמורפיים לכאורה 10,11,12,13. אבקות אלה יכולות להגיע היישר מבקבוק של מגיב קנוי, עמוד טיהור, או אפילו מריסוק גלולה לאבקה דקה10. אבקות אלה נראות אמורפיות בעין, אך עשויות להיות מורכבות לחלוטין מננו-גבישים או פשוט מכילות כמויות זעירות של משקעים ננו-גבישיים בחלק גדול יותר שאינו גבישי, אמורפי. היישום של החומר ברשת הוא קל, והשלבים הבאים של זיהוי, סינון ואיסוף נתונים עשויים אפילו להיות אוטומטיים בעתיד הקרוב14. בעוד שאחרים עשויים להשתמש בשיטות שונות להכנת דגימות ואיסוף נתונים, כאן מפורטים הפרוטוקולים שפותחו ושימשו במעבדת גונן להכנת דגימות של מולקולות קטנות עבור MicroED ואיסוף נתונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנת דגימה היא בדרך כלל תהליך איטרטיבי, שבו אופטימיזציות נעשות לאחר מפגשים של סינון ואיסוף נתונים. עבור דגימות של מולקולות קטנות, לעתים קרובות זה נבון לנסות תחילה להכין את הרשת מבלי לפרוק זוהר ברשתות, שכן תרופות רבות נוטות להיות הידרופוביות10,11. אם ברשתות יש …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מעבדת גונן נתמכת על ידי כספי המכון הרפואי הווארד יוז. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
