Difração de Elétrons Microcristal de Pequenas Moléculas
Summary
Aqui, descrevemos os procedimentos desenvolvidos em nosso laboratório para a preparação de pós de cristais de pequenas moléculas para experimentos de difração eletrônica de microcristais (MicroED).
Abstract
Um protocolo detalhado para a preparação de amostras de pequenas moléculas para experimentos de difração eletrônica de microcristais (MicroED) é descrito. O MicroED foi desenvolvido para resolver estruturas de proteínas e pequenas moléculas usando equipamentos de criomicroscopia eletrônica padrão (cryo-EM). Dessa forma, pequenas moléculas, peptídeos, proteínas solúveis e proteínas de membrana foram recentemente determinadas com altas resoluções. Protocolos são apresentados aqui para a preparação de grades de fármacos de pequenas moléculas usando o fármaco carbamazepina como exemplo. Protocolos para triagem e coleta de dados são apresentados. Etapas adicionais no processo geral, como integração de dados, determinação de estrutura e refinamento são apresentadas em outro lugar. Estima-se que o tempo necessário para preparar as grades de moléculas pequenas seja inferior a 30 min.
Introduction
A difração eletrônica de microcristais (MicroED) é um método de criomicroscopia eletrônica (crio-EM) para determinar estruturas de resolução atômica a partir de cristais de tamanho submicrométrico 1,2. Os cristais são aplicados a grades de microscópio eletrônico de transmissão padrão (TEM) e congelados mergulhando em etano líquido ou nitrogênio líquido. As grades são então carregadas em um MET operando em temperaturas criogênicas. Os cristais são localizados na grade e peneirados para a qualidade inicial da difração. Os dados MicroED de rotação contínua são coletados de um subconjunto dos cristais peneirados, onde os dados são salvos usando uma câmera rápida como um filme3. Esses filmes são convertidos para um formato cristalográfico padrão e processados quase de forma idêntica como um experimento de cristalografia de raios X4.
O MicroED foi originalmente desenvolvido para investigar microcristais de proteína 1,2. Um gargalo na cristalografia de proteínas é o crescimento de cristais grandes e bem ordenados para experimentos tradicionais de difração de raios X síncrotron. Como os elétrons interagem com ordens de magnitude da matéria mais fortes que os raios X, as limitações do tamanho do cristal necessário para produzir difração detectável é consideravelmente menor5. Além disso, a razão entre eventos de espalhamento elástico e inelástico é mais favorável para elétrons, sugerindo que dados mais úteis podem ser coletados com uma menor exposição global5. Desenvolvimentos constantes têm permitido a coleta de dados de MicroED a partir dos microcristais mais desafiadores 6,7,8,9.
Recentemente, o MicroED tem se mostrado uma poderosa ferramenta para determinar as estruturas de fármacos de pequenas moléculas a partir de materiais aparentemente amorfos10,11,12,13. Esses pós podem vir diretamente de um frasco de reagente comprado, de uma coluna de purificação ou até mesmo do esmagamento de uma pílula em um pó fino10. Esses pós parecem amorfos a olho nu, mas podem ser inteiramente compostos de nanocristais ou simplesmente conter traços de depósitos nanocristalinos em uma fração amorfa não cristalina maior. A aplicação do material na grade é fácil, e as etapas subsequentes de identificação de cristais, triagem e coleta de dados podem até ser automatizadas em um futuro próximo14. Enquanto outros podem utilizar diferentes métodos para preparação de amostras e coleta de dados, aqui são detalhados os protocolos desenvolvidos e utilizados no laboratório de Gonen para a preparação de amostras de pequenas moléculas para MicroED e para a coleta de dados.
Protocol
Representative Results
Discussion
A preparação da amostra é tipicamente um processo iterativo, onde as otimizações são feitas após sessões de triagem e coleta de dados. Para amostras de moléculas pequenas, muitas vezes é prudente tentar primeiro a preparação da grade sem descarga de brilho das grades, uma vez que muitos fármacos tendem a ser hidrofóbicos10,11. Se as grades tiverem poucos depósitos nanocristalinos, é uma boa ideia tentar novamente após a primeira descarga de brilh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O laboratório Gonen é apoiado por fundos do Howard Hughes Medical Institute. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
