Summary
여기에서는 미세 결정 전자 회절(MicroED) 실험을 위한 소분자 결정 분말을 준비하기 위해 실험실에서 개발된 절차를 설명합니다.
Abstract
미세결정 전자 회절(MicroED) 실험을 위한 소분자 샘플을 준비하기 위한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. MicroED는 표준 전자 극저온 현미경(Cryo-EM) 장비를 사용하여 단백질 및 소분자의 구조를 해결하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방식으로, 소분자, 펩티드, 가용성 단백질 및 막 단백질은 최근 고분해능으로 결정되었습니다. 카바마제핀이라는 약물을 예로 들어 소분자 의약품 그리드를 준비하기 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 데이터를 선별하고 수집하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 데이터 통합, 구조 결정 및 개선과 같은 전체 프로세스의 추가 단계는 다른 곳에서 제공됩니다. 소분자 그리드를 준비하는 데 필요한 시간은 30분 미만으로 추정됩니다.
Introduction
Microcrystal electron diffraction (MicroED)은 서브 마이크로미터 크기의 결정 1,2로부터 원자 분해능 구조를 결정하기 위한 전자 극저온 현미경(cryo-EM) 방법입니다. 결정은 표준 투과 전자 현미경 (TEM) 그리드에 적용되고 액체 에탄 또는 액체 질소에 뛰어 들어 동결됩니다. 그런 다음 그리드는 극저온에서 작동하는 TEM에 로드됩니다. 결정은 그리드에 위치하며 초기 회절 품질을 위해 스크리닝됩니다. 연속 회전 MicroED 데이터는 스크리닝된 결정의 하위 집합에서 수집되며, 여기서 데이터는 고속 카메라를 사용하여 동영상으로 저장됩니다3. 이들 영화는 표준 결정학 형식으로 변환되어 X선 결정학 실험과 거의 동일하게 처리된다4.
MicroED는 원래 단백질 미세 결정 1,2를 조사하기 위해 개발되었습니다. 단백질 결정학의 병목 현상은 전통적인 싱크로트론 X선 회절 실험을 위해 크고 잘 정돈된 결정을 성장시키는 것입니다. 전자가 X선보다 훨씬 더 강한 물질과 상호 작용하기 때문에 검출 가능한 회절을 생성하는 데 필요한 결정 크기의 한계는 상당히 작습니다5. 또한, 탄성 산란 사건에 대한 탄성 산란 사건의 비율은 전자에 더 유리하며, 이는 더 작은 전체 노출로 더 유용한 데이터를 수집할 수 있음을 시사한다5. 지속적인 개발로 인해 가장 까다로운 미세 결정 6,7,8,9에서 MicroED 데이터를 수집할 수 있었습니다.
최근에, MicroED는 겉보기에 비정질 물질로부터 소분자 의약품의 구조를 결정하기 위한 강력한 도구인 것으로 나타났다10,11,12,13. 이러한 분말은 구입한 시약 병, 정제 컬럼 또는 알약을 미세 분말로 분쇄하여 직접 얻을 수 있습니다10. 이 분말은 눈으로 볼 때 비정질로 보이지만 완전히 나노 결정으로 구성되거나 더 큰 비결정질, 비정질 분획에 미량의 나노 결정 침전물을 포함 할 수 있습니다. 그리드에 대한 물질의 적용은 용이하며, 결정 식별, 스크리닝 및 데이터 수집의 후속 단계는 가까운 장래에 자동화될 수도 있다(14). 다른 사람들은 샘플 준비 및 데이터 수집을 위해 다른 방법을 사용할 수 있지만, 여기에서는 MicroED 및 데이터 수집을 위한 소분자 샘플 준비를 위해 Gonen 실험실에서 개발 및 사용되는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.
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Protocol
1. 소분자 시료 준비
- 소량(0.01 - 1 mg)의 분말, 액체 또는 고체를 작은 바이알이나 튜브에 옮깁니다.
- 이미 분말 형태의 샘플의 경우 샘플이 필요할 때까지 캡을 사용하여 튜브를 밀봉합니다. 방법 1(단계 3) 또는 방법 2(단계 4)를 시도하기 전에 액체 샘플을 분말로 건조시킵니다.
참고: samples액체에 용해된 파일은 아래의 방법 3(5.X)을 사용할 수 있습니다.
2. TEM 그리드 준비
알림: 오토로더 시스템이 있는 일부 TEM은 TEM 컬럼에 로드하기 전에 그리드를 잘라서 카세트에 넣어야 합니다. 클리핑에는 3mm TEM 그리드를 오토로더가 조작할 수 있는 금속 링에 물리적으로 고정하는 작업이 포함됩니다. 이 단계 및 후속 단계는 노멀 TEM 그리드 또는 클리핑된 TEM 그리드를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이러한 실험의 경우 그리드가 미리 잘린 경우 그리드를 조작하는 것이 더 쉬운 경우가 많습니다.
- 유리 커버 슬라이드의 한쪽 끝에 플라스틱 필름을 감습니다.
- TEM 그리드를 탄소 면이 위를 향하도록 하여 커버 슬라이드 상단의 필름에 놓습니다. 조명 아래에서 그리드의 양면을 식별합니다. 구리 면은 빛나고 금속성으로 보이는 반면 탄소 면은 칙칙한 갈색으로 보입니다(그림 1C,D). 클리핑된 그리드의 경우 카본 면이 클립 링의 평평한 면을 향해야 합니다.
- 그리드가 있는 슬라이드를 글로우 방전 챔버에 넣습니다. 30pA에서 음수 설정을 사용하여 약 15초 동안 커버사이드를 글로우합니다. 그리드에 샘플을 추가하기 전에 여과지가 늘어선 유리 페트리 접시 내부의 커버 슬라이드에 그리드를 보관하십시오.
3. 균일한 미세 분말을 만들어 그리드에 시료 도포(방법 1)
- 핀셋을 사용하여 덮인 페트리 접시에서 글로우 방전 TEM 그리드를 제거합니다. 탄소 면이 위를 향하도록 하여 그리드를 원형 여과지에 놓습니다.
- 작은 주걱을 사용하여 아주 작은 스쿱의 분말(약 0.1mg)을 제거하고 여과지의 TEM 그리드 바로 옆에 있는 작은 정사각형 유리 커버슬립에 놓습니다. 분말 위에 또 다른 작은 정사각형 유리 슬라이드 또는 커버슬립을 놓습니다.
- 손가락으로 두 개의 유리 슬라이드를 부드럽게 문질러 미세한 가루를 만듭니다.
- 커버슬립의 각도를 조정하고 여과지의 TEM 그리드 바로 위에 배치하고 글로우 방전 TEM 그리드에서 불과 몇 cm 위에 커버슬립을 계속 문지릅니다(그림 1).
- 분말이 그리드 쪽으로 떨어지는지 관찰하십시오. 두 개의 유리 커버슬립 중 하나를 제거하여 잘게 분쇄된 분말을 추출합니다. 여과지를 사용하여 덮개 슬립에서 미세 분말을 TEM 그리드에 부드럽게 털어냅니다(그림 1).
4. "쉐이킹" 방법을 적용하여 그리드에 샘플 적용(방법 2)
- 핀셋을 사용하여 그리드를 잡고 분말 샘플의 바이알 또는 튜브에 떨어 뜨립니다. 흔들 때 재료가 새지 않도록 플라스틱 캡을 사용하여 바이알을 닫습니다.
- 바이알을 손에 쥐고 파우더와 그리드가 약 10-30 초 동안 움직이도록 바이알을 흔든다.
- 바이알 내용물을 원형 여과지에 비우십시오. 가장자리에서 그리드를 잡고 여과지의 그리드 가장자리를 부드럽게 두드려 그리드에서 과도한 재료를 제거합니다.
알림: 바이알의 종류와 크기에 따라 핀셋을 사용하여 내용물을 비우지 않고 TEM 그리드를 제거할 수도 있습니다.
5. 증발법을 이용하여 그리드에 시료 도포(방법 3)
- 탄소 면이 위를 향하고 구리 면이 아래를 향하도록 하여 원형 여과지 중앙에 그리드(잘렸는지 여부)를 놓습니다.
- 10 μL 기밀 주사기를 사용하여 용해된 화합물을 작은 방울(약 1 - 3 μL)로 그리드의 탄소 쪽에 묻습니다.
- 그리드가 있는 여과지를 진공 건조 챔버로 부드럽게 옮깁니다. 챔버를 덮고 진공을 켭니다. 그리드를 진공 상태로 두어 최대 하루 동안 건조시킵니다.
- 진공을 끄고 챔버가 5분 동안 환기되도록 합니다. 챔버를 환기시키면 그리드가 드러났을 때 그리드가 움직이거나 날아가는 것을 방지할 수 있습니다.
6. 그리드 동결 및 TEM에 로딩
- 핀셋 세트를 사용하여 TEM 그리드의 가장자리를 잡고 팁이 그리드 사각형에 구멍을 뚫지 않도록 합니다. 그리드를 여과지 위로 1 - 2cm 들어 올리고 그리드를 아래 용지에 대해 90°로 기울입니다. 그리드를 단단히 핀셋으로 유지하면서 핀셋을 부드럽게 두드려 느슨한 가루를 제거합니다.
- 그리드가 있는 핀셋 끝을 손으로 액체 질소 용기에 직접 움직여 그리드를 고정합니다. 이러한 용기는 전형적으로 TEM을 위한 그리드 로딩 스테이션이지만, 액체 질소 안전 보온병과 같은 임의의 안전한 용기일 수 있지만, 이송 또는 보관에 허용된다. 액체 질소는 -196 °C입니다.
- 추가 조작 전에 그리드와 핀셋이 끓는 것을 멈출 때까지 기다리십시오.
- 액체 질소 또는 질소 증기 아래에서 그리드를 샘플 홀더에 배치하여 샘플이 탄소 지지 필름 전에 빔에 부딪히도록 합니다.
- 샘플 홀더를 TEM에 로드하여 그리드가 항상 액체 질소 온도로 유지되도록 합니다.
- 오토로더 시스템의 경우 잘린 그리드를 액체 질소 냉각 용기의 카세트에 넣습니다. 이 카세트는 오토로더 로봇이 카세트를 수용하는 동시에 오토로더와 컬럼 사이를 이동할 수 있도록 샘플을 안전하게 유지하면서 캐틀링 컨테이너로 이송됩니다.
- 측면 진입 TEM 설정의 경우 그리드를 상업용 측면 진입 TEM 홀더에 고정합니다. 이 홀더에는 액체 질소로 채워진 샘플 준비 용기가 있어 샘플을 데우지 않고 그리드를 홀더로 옮길 수 있습니다. 측면 진입 홀더는 끝에 고정된 샘플과 함께 TEM에 직접 삽입됩니다.
7. MicroED 데이터 수집
- 나노결정 찾기 및 스크리닝
- TEM 컬럼 밸브를 엽니다. 핸드 패널을 사용하여 배율을 가능한 가장 낮은 배율로 조정합니다. 형광등 화면에 둥글고 밝은 영역이 보이도록 핸드 패널의 강도 노브를 조정하여 빔을 찾습니다.
- 적절한 소프트웨어 14,15,16을 사용하여 낮은 배율(50 - 300x)에서 전체 그리드 아틀라스를 가져옵니다(그림 2). 고해상도 MicroED 데이터를 수집하기 전에 현미경이 저배율 및 고배율 이미징 모두에 대해 잘 정렬되어 있는지 확인하십시오.
- 깨진 탄소가 없는 격자 사각형을 식별하고 필름에 검은색 또는 어두운 재료/입자가 보입니다(그림 2). 핸드 패널의 조이스틱을 물리적으로 사용하거나 수집된 아틀라스에서 가상으로 그리드를 탐색하여 깨지지 않고 미세 결정이 포함된 그리드 사각형을 검색합니다.
- 조사를 위해 각 사각형의 중심을 그리드 위치 목록에 추가합니다. 이러한 위치는 노트북, 현미경 사용자 인터페이스 또는 현미경 자동화 소프트웨어에 추가할 수 있습니다.
- 배율을 500-1,300x로 늘리고 저장된 각 그리드 위치에서 유센트릭 높이를 조정하고 저장된 Z 값을 7.1.4에 명시된 위치로 업데이트합니다.
- 형광 화면이나 고속 카메라에서 이 고배율로 그리드의 작은 검은 점/입자를 검색합니다. 좋은 샘플은 종종 고배율에서 날카로운 모서리를 가지고 있어 결정 순서를 암시합니다.
- 위치된 전위 수정을 화면 중앙으로 이동하고 TEM이 고배율 모드로 들어가도록 배율을 높입니다.
참고: 이를 다른 기기에서는 고배율, Zoom2 또는 SA 모드라고 하며 일반적으로 3,000배 이상의 배율에 해당합니다. - 선택한 영역 조리개를 삽입합니다. 조리개를 더 크거나 작은 크기로 변경하여 선택한 영역이 수정보다 약간 커지도록 합니다(그림 3).
- TEM 핸드 패널의 회절 버튼을 눌러 회절 모드로 전환하고 형광 스크린이 삽입되었는지 확인합니다. 가장자리가 최소 1Å 해상도가 되도록 확대 노브를 사용하여 카메라 길이를 조정합니다.
알림: 회절 길이의 보정은 MicroED 실험을 시도하기 전에 금 와플 격자 또는 알려진 표본을 사용하여 서비스 엔지니어가 수행해야 합니다. - 중심 지점이 가능한 한 선명하고 작도록 회절 초점을 조정합니다. 회절 이동 노브를 사용하여 중앙 빔을 형광 스크린의 중앙으로 이동합니다
- 빔 스톱을 삽입하고 빔이 그 뒤에 있는지 확인하십시오. 형광 스크린을 들어 올립니다. 카메라에 짧게(약 1초) 노출합니다(그림 4).
- 해당 회절 패턴을 검사합니다. 전체 데이터 세트를 수집하기에 적합한 후보는 열과 행에 규칙적으로 배열된 날카로운 반점을 가지며 회절은 2Å 이상, 바람직하게는 최소 1Å까지 확장됩니다(그림 4). 수정 좌표를 TEM 사용자 인터페이스에 저장하거나 기록해 둡니다.
- 현재 그리드 사각형에서 관심 있는 모든 잠재적 결정에 대해 회절 스크리닝을 반복합니다.
- 데이터 수집
- 스크린된 크리스탈을 고배율(> 1,000x)로 화면 중앙에 놓습니다. 자동 루틴을 사용하거나 손으로 크리스탈의 유센트릭 높이를 조정합니다.
- 7.1.8에서 결정된 대로 크리스탈 크기와 모양에 가장 잘 맞는 선택한 영역 조리개를 삽입합니다(그림 3). 이미지가 격자 막대에 의해 가려질 때까지 스테이지를 음수 방향과 양수 방향으로 기울입니다(그림 3). 데이터 수집을 위해 이러한 각도에 유의하십시오.
- 데이터 세트의 전체 각도 쐐기에 걸쳐 있는 데 필요한 프레임 수를 결정합니다. 각 프레임에 대해 0.5 - 1.0° 웨지를 사용하는 것이 일반적이며, 카메라의 감도에 따라 1-5초마다 프레임이 판독됩니다. 예를 들어, -30°에서 +30°에 걸쳐 있는 쐐기에서 1초마다 프레임이 판독되는 1° s-1 의 일정한 속도로 회전하려면 총 60개의 프레임이 필요합니다.
- 최대 총 틸트 범위가 -72°에서 +72°인 것을 고려하여 스테이지를 1° s-1 의 일정한 속도로 회전한 다음 롤링 셔터 판독 모드가 있는 최신 카메라에서 1초마다 데이터를 읽기 시작합니다(동영상 1). 이 프로세스는 수동으로 수행하거나 TEM 특정 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다.
- 현미경 사용자 인터페이스 또는 전용 소프트웨어에서 최대 틸트 속도의 %와 정지 시점을 지정하여 회전 속도를 설정합니다. 이 조사에서 이것은 최대 속도의 %당 0.3° s-1 로 측정되었지만 각 현미경에 대해 독립적으로 검증해야 합니다.
참고: 틸팅 및 카메라 데이터 수집은 여기에서 독립적으로 설정되지만, 소프트웨어 프로그램(14 )은 프로세스를 단순화하기 위해 이를 조정할 수 있다. - 대부분의 경우 지정된 쐐기의 양쪽에서 약 1°를 데드 타임으로 버리고, 여기서 stage는 원하는 회전 속도로 증가하거나 느려집니다.
- 현미경 사용자 인터페이스 또는 전용 소프트웨어에서 최대 틸트 속도의 %와 정지 시점을 지정하여 회전 속도를 설정합니다. 이 조사에서 이것은 최대 속도의 %당 0.3° s-1 로 측정되었지만 각 현미경에 대해 독립적으로 검증해야 합니다.
- 다양한 형식으로 데이터를 개별 프레임 또는 이미지 스택으로 저장합니다(동영상 1).
- MicroED 도구를 사용하여 이러한 회절 프레임을 일반적인 결정학 형식으로 변환하십시오 (여기(https://cryoem.ucla.edu)에서 사용 가능). SMV 포맷으로 저장된 회절 이미지는 문서화된 결정학 소프트웨어(17, 18)를 사용하여 쉽게 처리된다.
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Representative Results
MicroED는 전자와 물질 사이의 강한 상호 작용을 활용하는 cryoEM 방법으로, 사라지는 작은 결정12,13을 조사할 수 있습니다. 이러한 단계 후에, 미세결정으로부터 수집된 결정학적 형태의 회절 영화가 있을 것으로 예상된다(영화 1). 여기서, 이 기술은 카르바마제핀12를 사용하여 시연된다. 결과는 TEM 그리드에서 식별된 카르바마제핀 미세결정의 연속 회전 MicroED 데이터 세트를 보여줍니다(동영상 1). 좋은 데이터 세트는 번지거나 쪼개지지 않는 강하고 선명한 반점을 가지고 있으며, 각 프레임에는 영화19를 통해 쉽게 따라갈 수 있는 하나의 격자만 있습니다. 이러한 데이터는 표준 X선 결정학 소프트웨어(4)를 사용하여 쉽게 인덱싱, 통합 및 스케일링할 수 있습니다. 갈라진 점들은 금이 간 결정에서 볼 수 있고, 같은 결정의 두 방향이 밀접하게 정렬되어 있지만, 완전히 일치하지는 않는다19. 특히 이러한 소분자 결정의 경우 여러 개의 단일 결정이 그리드의 덩어리에 함께 붙어 있는 다중 격자가 발생할 수도 있습니다. 또 다른 일반적인 시나리오는 조각화 과정에서 결정이 잘못 동결되거나 너무 가혹하게 처리되어 회절이 관찰되지 않는 경우입니다9.
데이터 수집, 통합 및 구조 솔루션 후에는 고해상도 구조가 결정될 것으로 예상됩니다(그림 5). 명확한 구조 솔루션을 얻는 것은 궁극적으로 데이터의 품질과 완전성에 달려 있습니다.
그림 1: 소분자 조사를 위한 사전 클리핑된 TEM 그리드 준비 . (A) 조사를 위한 샘플의 작은 부분이 있는 튜브. (B) 두 현미경 슬라이드 사이의 분쇄된 샘플. (C) 미리 클리핑된 그리드의 탄소 측면, 및 (D) 미리 클리핑된 그리드의 구리 측면. (E) 분쇄된 분말을 그 위에 떨어뜨린 후 미리 클리핑된 TEM 그리드. 스케일 바는 (C), (D) 및 (E)에서 3mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: TEM에서 소분자 결정 식별 . (A) 저배율의 전체 그리드 아틀라스 또는 몽타주. (B) 스크리닝에 사용되는 단일 저배율 이미지. (C) 더 작은 입자를 식별하는 데 사용되는 고배율 이미지. (D) 응집된 소분자 결정의 고배율 현미경 사진. 스케일 바 750 μm in (A), 50 μm in (B), 10 μm in (C), 1 μm in (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: MicroED 데이터 수집을 위한 미세결정 스크리닝 및 정렬 . (A) 미세 결정의 고배율 현미경 사진. (B) 선택된 영역 개구부 내에서 분리된 결정의 현미경 사진. (C) 스테이지가 -69 °로 기울어 진 조리개에서 동일한 미세 결정. 스케일 바는 모두 1 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: MicroED 데이터의 예. (A) 고해상도 구조 결정에 적합한 선명하고 날카로운 지점이 있는 고품질 MicroED 데이터. (B) 격자 정의가 좋지 않은 약하고 번진 MicroED 데이터. 이 예에서는 정렬도 꺼져 있으므로 회절은 이미지의 한 면에서만 분명합니다(C) 여러 격자와 분할 및/또는 번진 반점을 보여주는 불량한 MicroED 데이터. 오른쪽 하단에 강화된 파란색 영역의 삽입은 번지고 갈라진 반점을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 카르바마제핀의 MicroED 구조. 탄소 원자가 흰색, 산소 적색 및 질소 청색으로 표시된 막대기로 표시된 원자 모델. 2Fo-F c 맵은 1.5 σ 레벨에서 윤곽이 그려져 있으며 파란색으로 표시됩니다. 수소를 보여주는 Fo-F c 지도는 3.0 σ 수준에서 윤곽이 그려져 있고 녹색으로 표시됩니다. 이 그림은 EMDB-928410의 기탁 된지도에서 발췌 한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: 카르바마제핀의 MicroED 데이터 세트. 데이터 세트는 -68°에서 +20°까지 거의 90°에 걸쳐 있습니다. 각 회절 패턴은 역수 공간에서 0.5°의 쐐기에 걸쳐 있으며 0.01 e-Å-2 s-1의 노광률에서 1초의 노광에 해당합니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
시료 전처리는 일반적으로 스크리닝 및 데이터 수집 세션 후에 최적화가 이루어지는 반복적인 프로세스입니다. 소분자 샘플의 경우, 많은 의약품이 소수성인 경향이 있기 때문에 그리드를 글로우 방전하지 않고 그리드 준비를 먼저 시도하는 것이 종종 현명합니다10,11. 그리드에 나노 결정 침전물이 너무 적으면 그리드를 먼저 글로우 방전한 후 다시 시도하는 것이 좋습니다. 동결건조된 분말의 결정이 너무 크고 두꺼워서 좋은 데이터를 수집할 수 없는 경우일 수 있습니다. 이러한 경우 더 큰 결정의 가장자리 또는 더 얇은 부분에서 데이터를 수집할 수 있습니다. 이것이 어려운 것으로 판명되면 모르타르 및 유봉과 같은 더 거친 표면을 사용하여 분말을 더 미세한 농도로 분쇄해야 할 수 있습니다.
MicroED 데이터는 일반적으로 마이크로프로브 모드 4,20에서 작동하는 TEM으로 수집됩니다. 여기서, 0.01 e-Å-2s-1의 노광률에 해당하는 TEM 빔의 크기는 전형적으로 직경이 약 10 μm이며, 이는 전형적인 미세결정 1,21보다 훨씬 크다. 그런 다음 신호는 선택한 영역 조리개를 사용하여 관심 있는 결정에서 분리됩니다(그림 3)2,20. 다양한 조리개 크기를 통해 다양한 크기의 크리스탈에 맞게 설정을 빠르게 조정할 수 있습니다. 대안적으로, 나노프로브 모드에서 동작하는 TEM으로 데이터를 수집할 수 있다. 이렇게 하면 빔의 크기가 약 5배 줄어듭니다. 더 작은 빔은 빔 풋프린트에서 그에 상응하는 더 높은 노출률에 해당합니다. 많은 TEM이 두 개의 콘덴서 렌즈 시스템이기 때문에 병렬 조건은 빔이 마이크로 프로브 또는 나노 프로브 모드에서 단일 크기가 되도록 지시합니다. 건 렌즈를 조정하지 않고 나노 프로브에서 0.01 e-Å-2 s-1의 노출률에 도달하는 것은 어렵습니다. 둘 중 하나를 선택하는 것은 사용자의 몫입니다. 나노 프로브의 장점은 이미징 및 회절 작동 모드에서 스크리닝 사이에 선택된 영역 구멍을 삽입하고 수축시킬 필요가 적다는 것입니다. 그러나 최신 현미경에서는 SA 조리개의 삽입 및 수축이 자동으로 이루어지며 정확합니다. Microprobe는 여러 크기의 선택된 영역 조리개에 접근할 수 있어 회절을 분리하는 데 더 큰 유연성을 제공합니다. 마이크로 프로브의 더 큰 빔은 근처의 결정을 노출시킬 수도 있지만 나노 프로브는 개별 결정을보다 정확하게 타겟팅 할 수 있습니다.
제시된 프로토콜은 실험실10,11,12,13에서 사용되는 소분자에 대한 MicroED 데이터 수집에 대한 표준 접근 방식입니다. 구현할 수 있는 많은 조정과 수정이 있습니다. 결정 밀도가 높은 그리드를 만드는 가장 좋은 방법은 주어진 접근 방식에 대한 사용자의 친숙도에 가장 많이 의존합니다. 약물이 회절력을 잃지 않고 물리적으로 파편화하기에는 너무 연약한 큰 결정으로 존재하는 경우가 많다19. 이러한 경우, 최근에 채택된 집속 이온빔 밀링 방법을 사용하여 결정을 얇게 하여 MicroED 6,7,8,9,22에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Gonen 연구소는 Howard Hughes Medical Institute의 기금으로 지원됩니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health) P41GM136508의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
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