Summary
Provberedning för kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) är en betydande flaskhals i arbetsflödet för strukturbestämning av denna metod. Här tillhandahåller vi detaljerade metoder för att använda ett lätt att använda, tredimensionellt tryckt block för beredning av stödfilmer för att stabilisera prover för överförings-EM-studier.
Abstract
Strukturbestämning genom kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) har snabbt vuxit under det senaste decenniet; Provberedningen är dock fortfarande en betydande flaskhals. Makromolekylära prover avbildas idealiskt direkt från slumpmässiga orienteringar i ett tunt lager av glasaktig is. Många prover är dock eldfasta till detta, och protein denaturation vid luft-vatten gränssnittet är ett vanligt problem. För att övervinna sådana problem kan stödfilmer, inklusive amorft kol, grafen och grafenoxid - appliceras på nätet för att tillhandahålla en yta som prover kan fylla, vilket minskar sannolikheten för att partiklar upplever de skadliga effekterna av luft-vattengränssnittet. Tillämpningen av dessa känsliga stöd på galler kräver dock noggrann hantering för att förhindra brott, luftburen förorening eller omfattande tvätt- och rengöringssteg. En färsk rapport beskriver utvecklingen av ett lättåtkomligt flytblock som underlättar våt överföring av stödfilmer direkt till urvalet. Användningen av blocket minimerar antalet manuella hanteringssteg som krävs, bevarar stödfilmens fysiska integritet och den tid under vilken hydrofobisk förorening kan uppstå, vilket säkerställer att en tunn isfilm fortfarande kan genereras. Detta dokument ger steg-för-steg protokoll för beredning av kol, grafen och grafenoxid stöd för EM-studier.
Introduction
Under det senaste decenniet har genombrott, främst inom detektorteknik, men även inom andra tekniska områden, underlättat en rad betydande ökningar av den upplösning vid vilken biologiskt relevanta system kan avbildas genom transmissionselektronmikroskopi (TEM)1,2. Trots att cryo-EM redan tillåter upplösning av högupplösta strukturer från så lite som 50 μg protein genom enpartikelanalys (SPA), är kryo-EM-prov och nätberedning fortfarande stora flaskhalsar3,4,5. SPA-prover består av makromolekyler som distribueras ungefär slumpmässigt inom ett lager av glasaktig is. Isen måste vara så tunn som möjligt för att maximera kontrastskillnaden mellan partiklarna och lösningsmedlet. Biologiska makromolekyler är stabilare (dvs. mindre benägna att förlora sin inhemska struktur) i tjockare is, eftersom de förblir bättre solvated. Dessutom visar det sig ofta att partiklar är mycket bättre fördelade över synfältet i is som är mycket tjockare än partikelstorleken6 och ofta kanske inte finns i hål i kolfilmerna alls.
Dessutom minskar tjockare lager av is sannolikheten för att molekyler är nära luft-vattengränssnittet på grund av det höga förhållandet mellan yta och volym, och det har uppskattats att användning av vanliga dykfrysningsmetoder för kryo-EM-studier resulterar i adsorption av ~ 90% av partiklarna till luft-vattengränssnittet7. Tjockare is resulterar i oönskad hög bakgrund på grund av ökade spridningshändelser i lösningsmedlet och samtidig dämpning av signalen6,7. Det är därför nödvändigt att uppnå ett så tunt lager glasaktig is som möjligt. helst skulle skiktet bara vara något tjockare än partikeln. Utmaningen för forskaren, som måste övervinnas för varje olika prov som appliceras på ett galler, är att förbereda exemplar som är tillräckligt tunna för högkontrastavbildning samtidigt som partiklarnas strukturella integritet i provet bibehålls. Proteinadsorption till luft-vattengränssnittet åtföljs av flera, vanligtvis skadliga, effekter.
För det första inducerar bindning av proteiner till detta hydrofoba gränssnitt ofta denaturering av proteinet, som fortsätter snabbt och är vanligtvis irreversibelt8,9. En studie utförd med jästfettsyrasyntas visade att upp till 90% av adsorberade partiklar är denaturerade10. För det andra visade bevis från en studie som jämförde orienteringsfördelningen av 80S ribosomdatamängder som samlats in antingen på amorft kol11 eller utan stöd12 att luft-vattengränssnittet kan orsaka allvarlig förmånsorientering som äventyrar 3D-rekonstruktionen av volymen13. Metoder för att minska partikelinteraktion med luft-vattengränssnittet inkluderar tillskott av frysbufferten med tensider (såsom tvättmedel), användning av stödfilmer, affinitetsfångst eller byggnadsställningar av substrat och accelererade plungtider. Användningen av tensider är förknippad med sina egna problem, eftersom vissa proteinprover kan bete sig icke-idealiskt i sin närvaro, medan affinitetsfångande och byggnadsställningar i allmänhet kräver tekniska skräddarsydda nätytor och fångststrategier. Slutligen, även om det finns mycket forskning om utvecklingen av snabbslungande enheter14,15,16, kräver dessa apparater som i allmänhet inte är allmänt tillgängliga.
Även om det vanliga TEM-nätet för biologisk kryo-EM redan har en perforerad amorf kolfolie17, finns det ett antal protokoll tillgängliga för generering av ytterligare stödfilmer och deras överföring till TEM-nät. Användningen av dessa filmer är en sedan länge etablerad metod för provstabilisering18. Amorfa kolstöd genereras genom avdunstning och deponering på kristallina glimmerplåtar19, från vilka lagren kan flyta på galler, med nyttan av flytstöd som användbara verktyg som fastställts i tidigare rapporter20. Grafenoxidflingor, vanligtvis beredda med hjälp av en modifierad version av Hummers-metoden21, har använts som en föredragen stödstruktur framför amorft kol för deras minskade bakgrundssignal samt förmågan att immobilisera och stabilisera makromolekyler22. På senare tid har intresset för användning av grafen ökat som TEM-stödfilm på grund av dess mekaniska stabilitet, höga konduktivitet, extremt låga bidrag till bakgrundsljud23, liksom framväxten av reproducerbara metoder för att generera makroskopiskt stora områden av monoskiktsgrafen24 och överföra den till TEM-nät25 . Jämfört med amorft kol, som genomgår strålinducerade rörelser på samma sätt som, eller värre, än is som saknar en stödfilm11,12,17, visade grafen en signifikant minskning av stråleinducerad rörelse av kryo-EM-bilder12.
Men medan hydrofiliserad grafen skyddade fettsyrasyntas från luft-vatten interfacial denaturation, författarna till denna studie noterade att grafen blev förorenade under provberedning, sannolikt på grund av en kombination av atmosfärisk kolväte förorening och från reagens som används för att hydrofilisera galler10. Trots många av grafenens överlägsna egenskaper hindras dess utbredda användning fortfarande av den härledning som krävs för att minska dess hydrofobi12, vilket i slutändan är kemiskt svårt och kräver specialistutrustning. Detta dokument rapporterar protokoll för beredning av amorft kol, grafenoxid och grafenprov stöder användning av ett tredimensionellt (3D) tryckt provflöten27 för att direkt överföra stödfilmer från de substrat på vilka de genererades till TEM-nät (figur 1). En viktig fördel med att använda en sådan anordning är den fuktade överföringen av filmer, minimering av hydrofobisk förorening av stöden och följaktligen behovet av ytterligare behandling och minskning av antalet potentiellt skadliga manuella hanteringssteg. Dessa metoder är billiga att genomföra och därför allmänt tillgängliga och tillämpliga för kryo-EM-studier där provstöd är nödvändiga.
Protocol
1. Allmän förberedelse av TEM-nät före supportöverföring
- Använd ett par rena, fina pincett, lyft och dränk TEM-galler sekventiellt i dubbeldestillerat vatten (ddH2O) eller ultrapurvatten i 10-15 s, följt av etylacetat, i 10-15 s.
OBS: Här användes negativ-action, sned spets pincett. - Placera pincetterna, med gallret fortfarande i grepp, på ena sidan för att lufttorka i ~5 min.
- Plasmarensa gallret för att avlägsna ytan av eventuella föroreningar som uppkommit genom luft- eller tvättstegen.
OBS: Här gjordes plasmarengöring för 10-15 s i luften med en radiofrekvenseffekt på 25 W.
2. Allmän förberedelse av reagenslösningar
- Uranylacetatlösning (UAc) (2% v/v)
- Linda ett 50 ml rör i folie, fyll med 50 ml ultrapurvatten och tillsätt 1 g UAc-pulver.
OBS: UAc är ljuskänsligt och fälls ut över tid när det exponeras. Eftersom UAc är radioaktivt och giftigt, upprätthålla en hög renhetsnivå. Med den allvarligaste faran till följd av inandning eller förtäring bör extra försiktighet iakttas för att förhindra att fina partiklar andas in. Handskar måste alltid bäras vid hantering eller vägning av uransalterna. Masker och skyddsglasögon rekommenderas starkt. Uransalter skall bortskaffas i enlighet med de rättsliga krav som fastställts för radioaktiva faror inom staten. - Låt lösningen röras i 1 h så att alla UAc kan lösas upp. Förvara vid 4°C.
- Filtrera 1 ml av fläcklösningen före användning i en liten flaska med hjälp av 0,22 μm-filter för att avlägsna eventuella återstående acetatkristaller.
- Linda ett 50 ml rör i folie, fyll med 50 ml ultrapurvatten och tillsätt 1 g UAc-pulver.
- Suspension av grafenoxid (GrOx)
- Pipettera 2,5 μL GrOx till ett 1,5 ml rör (1% slutlig koncentration). Pipett 2,5 μL 10 % (w/v) n-dodecyl β-D-maltosid (DDM) i GrOx och blanda försiktigt (0,1 % (w/v) slutlig koncentration).
- Tillsätt 245 μL ultrapurvatten till GrOx-DDM-blandningen och virvla omedelbart kraftigt i 5 minuter.
- Järn(III) kloridlösning (FeCl3) (10 % v/v)
- Väg försiktigt 5 g FeCl3 i en vägningsbåt. Överför till en 100 ml mätcylinder som innehåller 35 ml ddH2O och en magnetisk omrörningsstång.
- Placera på en magnetisk omrörningsplatta och lös upp FeCl3 och tillsätt ddH2O till en slutlig volym på 50 ml. Filtrera FeCl3-lösningen genom ett 0,8 μm sprutafilter till en ren flaska för förvaring.
OBS: FeCl3 är frätande och irriterande; tvätta händer och andra utsatta områden med mild tvål och vatten innan du äter, dricker eller röker och när du lämnar arbetet. Ge god ventilation i processområdet för att förhindra bildandet av ånga. Andas inte dimma, ångor, spray. Handskar måste alltid bäras vid hantering eller vägning av saltet. Masker och skyddsglasögon rekommenderas starkt när de används.
3. Buffertutbyte för kolstödsfilmer på glimmer för att förbereda negativt färgade prover med hjälp av stödflottörsblocket
- Tvätta och plasmarengöra TEM-galler.
OBS: Här användes 300 meshhåliga kopparnät enligt beskrivningen ovan i avsnitt 1. - Pipett 10-12 μL prov i buffertutbytesbrunn (med de små kanalerna) i flytblocket och 10-12 μL 2% UAc-lösning (se avsnitt 2.1) för negativ färgning i den intilliggande icke-buffertutbytesbrunn.
OBS: Brunnen har en volym på 10 μL; Justera dock provvolymen så att en konvex menisk bildas vid vätskans yta för att möjliggöra korrekt filmflötet. En låg mängd prov kan orsaka filmbrott. - Skär försiktigt två små bitar av glimmer med fördefinierad kolfilm på toppen. Se till att glimmerfragmenten är tillräckligt breda för att passa in i brunnen (3,4 mm bredd) och längre än brunnslängden (3,45 mm), så att fragmentet sitter på brunnen medan kolet flyter, och det finns tillräckligt med utrymme för att hantera fragmentet med pincetterna.
OBS: För att hantera kolet, använd platta negativa långspets pincett. När du skär glimmerfragmenten ska du skära med enstaka rörelser för att upprätthålla kolfilmens integritet. - Sänk ner glimmern i brunnen med en ungefärlig vinkel på 45° tills glimmern sitter på brunnens ramp och ett skikt av kol observeras vid ytan av det flytande provet.
- Efter den första inkubationen på provet (vanligtvis 20 s till 20 min beroende på provslutning, optimera denna period baserat på experimentella behov), dra tillbaka glimmerbladet mycket långsamt för att återvinna kolfilmen och minimera kvarvarande viskös provretention.
- Torka försiktigt glimmern genom att knacka på den nedre ytan (icke-kolsidan) med filterpapper för att avlägsna överflödig vätska och byt sedan ut kolet som bär provet till negativ fläck genom applicering till motsatt brunn (dvs. sänk ner glimmer glimmer som i steg 3.4) som innehåller 2% UAc-lösningen.
OBS: Ett kolskikt bör observeras flytande ovanpå fläcklösningen vid denna punkt. - Återvinn det flytande kolskiktet med den håliga koltäckta sidan av ett tvättat och plasmarengjort EM-galler. Låt gallren lufttorka tills de avbildas på ett TEM. Täck helst gallret under torkningsprocessen för att undvika luftburen förorening.
4. Användning av stödflottörsblocket för att förbereda grafenoxidbelagda TEM-galler
- Tvätta och plasmarengöra TEM-galler med hjälp av 300 meshhåliga kopparnät enligt beskrivningen ovan (avsnitt 1).
- Pipetter 10-12 μL GrOx-fjädring (se avsnitt 2.2) i de 4 icke-buffertutbytesbrunnarna längs flytblocket. Pipetten 10-12 μL ddH2O eller ultrapure vatten i de återstående 4 buffertutbytesbrunnarna i blocket.
OBS: Denna vattenvolym bör vara tillräcklig för att bilda en liten konvex menisk som stiger över blockets höjd. - Släpp 4 galler försiktigt på GrOx-fjädringen i varje brunn i 1 min, vilket säkerställer att den håliga koltäckta sidan kommer i kontakt med lösningen. Efter 1 min, återställ varje rutnät försiktigt genom att skjuta pincetterna i pincettspåret i varje icke-buffertutbytesbrunn.
- Rör mycket försiktigt och kort vid den koppar, icke-koltäckta sidan av varje galler till ddH2O i den intilliggande brunnen. Håll sedan försiktigt och försiktigt gallret, vattendroppesidan nedåt, mot ett filterpapper.
OBS: Att blotta av vattnet kommer att dra GrOx-fjädringen genom gallret genom kapillärverkan. Det är viktigt att undvika att sänka gallret i ddH2O, så kontakten bör vara mycket kort. När gallret lyfts ska en droppe vatten hålla fast vid undersidan av gallret. Var försiktig så att du inte flyttar gallret på filterpapperet eftersom detta kan störa avvecklingen av GrOx-flingorna. - Låt gallret i pincetterna lufttorka tills de är klara med provet. Täck helst gallret under torkningsprocessen för att undvika luftburen förorening.
5. Tillämpning av stödflottörsblocket för beredning av prover på monoskiktsgrafenfilmer
- Tvätta TEM-gallret enligt beskrivningen ovan (avsnitt 1), men utelämna plasmarengöring.
OBS: Här användes 300 mesh holey-carbon guldnät, men andra icke-kopparnät eller kopparlegeringsnät är också genomförbara. - För att deponera galler med grafen, överför direkt från grafen som odlas på koppar (Cu-grafen) substrat till kryo-EM-galler, som beskrivits tidigare25.
- Placera fyra tvättade galler ovanpå ett Cu-grafenark (10 mm × 10 mm) som deponerats på en glasrutschbana och täck varje galler med en droppe isopropanol (5-10 μL) för att möjliggöra intim kontakt mellan monoskiktsgrafenet och gallret.
OBS: Se till att placera den håliga koltäckta sidan av gallret i kontakt med grafenplåten. - När isopropanolen är helt avdunstad (vanligtvis 2 h), flyta Cu-grafenplåten med galler på 10% (w/v) FeCl3-lösning (se avsnitt 2.3) i en petriskål i glas och låt etsa vid rumstemperatur över natten. Täck skålen för att undvika luftburen förorening.
OBS: När etsningen är klar kommer endast grafenmonolagret att förbli flytande på FeCl3-lösningen - detta bör vara synligt med ögon med lämplig belysning. - Använd en slinga med diameter större än TEM-rutnätets storlek för att fiska gallret som flyter på grafenmonolagret och överför försiktigt till en petriskål i glas som innehåller ddH2O för att tvätta.
OBS: Var extremt försiktig när du fiskar gallret för att undvika att träffa väggarna i Petri-skålen, vilket kan orsaka grafenfilmbrott eller böjning. - Tvätta ytterligare två gånger i vatten genom fiskenät och överför till en ren Petri-maträtt som innehåller ddH2O för att ta bort all kvarvarande FeCl3. Överför slutligen galler till en Petri-skål som innehåller provbuffert tills provberedning och doppfrysning.
OBS: Den grafentäckta sidan av gallret måste alltid hållas våt för att undvika att de utsätts för luftburna föroreningar.
- Placera fyra tvättade galler ovanpå ett Cu-grafenark (10 mm × 10 mm) som deponerats på en glasrutschbana och täck varje galler med en droppe isopropanol (5-10 μL) för att möjliggöra intim kontakt mellan monoskiktsgrafenet och gallret.
- Pipettera provet (10-12 μL) till en icke-buffertutbytesbrunn i flytblocket. När provet är klart i blocket plockar du ett grafenbelagt galler från buffertlösningen med hjälp av ett par rena pincett och placerar på ytan av den provinnehållande brunnen.
- Efter en lämplig inkubationstid (1-5 min beroende på provet; optimera enligt experimentella behov), välj gallret med ett par rena frys pincett och fortsätt med blotting och vitrifikation.
Representative Results
TEM-nät som bereds med amorfa kolstöd täcks vanligtvis över hela rutnätsytan. Även om brott av kolfilmen sker i vissa fall tillsammans med viss ruffling (figur 2A), är ett stort antal rutnätsrutor orörda och därmed allmänt tillämpliga för negativa färgningsändamål. Den viktigaste faktorn som påverkar stödets integritet är koltjockleken, som bestäms vid kolavdunstning. På samma sätt uppnås med detta GrOx-protokoll rutinmässigt god täckning över hela rutnätet (figur 2B). En enda applicering av GrOx-fjädring i 1 min är tillräcklig för att säkerställa få områden med flera lager, som är lätta att se på grund av flagkanter. GrOx-galler kan snabbt beredas av råmaterial och är mycket skyddande för provet. Flingor, ofullständig täckning och ruffling är dock oftare synliga med GrOx-galler än för de andra teknikerna på grund av GrOx-flagornas natur.
Även om grafenstödfilmens integritet, som det amorfa kolet, beror på depositionsprocessen, visar områden som är väl täckta det karakteristiska diffraktionsmönstret för enskiktsgrafen. Viktigt är att genom att hålla grafenstödsfilmer fuktade kan prover återvinnas från flottörblocket efter en inkubationsperiod och data som samlas in på ett sätt som är mottagligt för enpartikelanalys. Denna metod kräver ingen annan behandling av grafenet för vätning, vilket avlägsnar kravet på dyr utrustning för att göra grafen hydrofil, och det är bäst att förbereda stödfilmer strax före provberedning och nätfrysning (figur 2C).
Bild 1: Exempel på konstruktion och applicering av flytblock under stödfilmberedningen. Spåret för pincettspetsar att vila, liksom kanaler för att sätta in nålar, anges. B) Amorfa kollager kan lätt flyta på ytan av bufferten som finns i flytblockets brunnar med hjälp av rampen, dvs. (C) Brunnarnas bredd är lämplig för att rymma ett TEM-galler, medan pincettspåren minskar behovet av att släppa ut och plocka upp galler i onödan under förberedelsestegen, men erbjuder en definierad väg för att återställa galler utan risk för böjning om galler frigörs. Bilder i B ändras från 27. Förkortning: TEM = transmissionselektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Typiska exempel på exempelstödfilmer som bereds med hjälp av flötblocket. Rutnätsrutor (vänster) och bild (höger) visas för (A) amorft kol, (B) grafenoxid och (C) grafenstödfilmer som beretts med hjälp av flytblocket. Amorfa kol stöd användes vid beredning av 70S ribosomer för negativa färgning, medan grafenoxid och grafen stöd användes vid beredning av 70S ribosomer för cryo-EM. Bilderna i A och C ändras från 27. Skalningslist för A rutnätsruta = 10 μm; Skalstänger för B- och C-rutnätsrutor = 5 μm; skalningsfält för A-C-bildvyer = 50 nm. Förkortning: cryo-EM = kryoelektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Detta dokument presenterar protokoll för hantering av både amorfa kol- och grafenfilmer för kryo-EM-provberedning med hjälp av ett provflötenblock27. En STL-fil för supportblocket är fritt tillgänglig från det offentliga Thingiverse-arkivet [www.thingiverse.com/thing:3440684], och kan 3D-skrivas ut med vilken lämplig stereolitografiskrivare som helst från ett lämpligt harts. Användningen av kolfilmer som täcker ett TEM-nät innebär vanligtvis att kolet flyter på provet28. Detta tillvägagångssätt för att förbereda negativa fläcknät minimerar luftexponeringen under supporthantering, vilket minskar förorening och proteindenaturering. Beredningen av galler som använder flytande kol i små brunnar är fördelaktigt för att flyta en större yta, dvs. i ett vattenbad eller Petriskål, i vilket fall mekanisk klippning av kolet sker mycket lättare.
UAc kan vara svårt att köpa på grund av gällande hälso- och säkerhetsbestämmelser vid tidpunkten för publiceringen. Många andra vanliga, icke-radioaktiva, negativa färgning reagenser finns tillgängliga, och protokoll för deras beredning har beskrivits tidigare29. Även om alternativa fläckar inte har använts med detta stödflottörblock, är det inte troligt att det skulle finnas några skillnader i dessa protokoll förutom optimering av inkubationstiden med prov (steg 3.5), som redan i sig är provberoende. Det viktigaste steget i detta GrOx-supportförberedelseprotokoll är steg 4.4, som markeras av anteckningen för att förhindra att vatten- och GrOx-lösningen kommer i kontakt runt gallerkanten. Olämplig blandning av vatten- och GrOx-lösningar förhindrar enkelriktad sedimentering av GrOx-flingorna genom kapillärverkan. Att ha GrOx-flingor på båda sidor av kolfolien resulterar i tjocka lager, vilket negerar fördelarna med att använda GrOx som ett nästan enda lagerstöd, samt att fånga vatten mellan flingorna, vilket orsakar förorening av användbara områden med ytterligare lager av is. Grafenoxid stöd beredning är relativt lätt att uppnå med hjälp av droppar av lösning på flexibel polyolefin film. När det utförs på detta sätt är det dock lättare att oavsiktligt förorena kopparsidan av nätet genom felhanteringsfel; Användningen av flytblocket minskar sannolikheten för denna eventualitet.
Slutligen presenterar detta dokument ett protokoll för att förbereda grafentäckta galler som undviker någon form av grafenförbehandling för att göra det hydrofilt, vilket minskar dess kostnad och ökar dess tillgänglighet. Att underhålla en fuktad film under hela provberedningen och applicera provet in situ i blocket strax före frysning är tillräckligt för att möjliggöra generering av lämpliga islager för kryo-EM med en homogen provfördelning. Sammantaget minimerar protokollen som presenteras här provkontakten med luft-vattengränssnittet, vilket minskar provav denaturering och stöder förorening. För de tre stödfilmer som används i dessa metoder skulle homogena provfördelningar kunna uppnås över rutnäten tillsammans med avbildning av intakta, välbevarade enskilda partiklar.
Disclosures
Författarna är inte medvetna om några intressekonflikter med avseende på detta arbete.
Acknowledgments
Författarna vill tacka alla medlemmar i sektionen för struktur - syntetisk biologi vid Imperial College London som har hjälpt till att testa dessa tekniker, liksom Harry Barnett vid Imperial College Advanced Hackspace och Paul Simpson vid Centre for Structural Biology. CHSA stöds av ett Sir Henry Dale Fellowship som finansieras gemensamt av Wellcome Trust och Royal Society (206212/Z/17/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
References
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), Oxford, England. 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E.
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
