Gerenciamento Avançado do Ritmo Cardíaco Aplicando Fotoestimulação Optogenética Multi-Site em Corações Murinos
Summary
Este trabalho relata um método de controle do ritmo cardíaco de corações murinos intactos de camundongos transgênicos com canalrodopsina-2 (ChR2) utilizando fotoestimulação local com matriz micro-LED e mapeamento óptico simultâneo do potencial de membrana epicárdica.
Abstract
As taquiarritmias ventriculares são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. A desfibrilação elétrica usando choques elétricos de alta energia é atualmente o único tratamento para fibrilação ventricular com risco de vida. No entanto, a desfibrilação pode ter efeitos colaterais, incluindo dor intolerável, danos teciduais e piora do prognóstico, indicando uma necessidade médica significativa para o desenvolvimento de estratégias de manejo do ritmo cardíaco mais suaves. Além das abordagens elétricas redutoras de energia, a optogenética cardíaca foi introduzida como uma ferramenta poderosa para influenciar a atividade cardíaca usando canais iônicos de membrana sensíveis à luz e pulsos de luz. No presente estudo, um método robusto e válido para fotoestimulação bem-sucedida de corações murinos intactos perfundidos de Langendorff será descrito com base na estimulação multi-local aplicando uma matriz 3 x 3 de microdiodos emissores de luz (micro-LED). O mapeamento óptico simultâneo das ondas de tensão da membrana epicárdica permite a investigação dos efeitos da estimulação específica da região e avalia a atividade cardíaca recém-induzida diretamente no local. Os resultados obtidos mostram que a eficácia da desfibrilação é fortemente dependente dos parâmetros escolhidos para a fotoestimulação durante uma arritmia cardíaca. Será demonstrado que a área iluminada do coração desempenha um papel crucial para o sucesso da terminação, bem como a forma como o controle direcionado da atividade cardíaca durante a iluminação para modificar os padrões de arritmia pode ser alcançado. Em resumo, essa técnica oferece a possibilidade de otimizar a manipulação do mecanismo no local no caminho para o controle de feedback em tempo real do ritmo cardíaco e, em relação à especificidade da região, novas abordagens na redução do dano potencial ao sistema cardíaco em comparação com o uso de aplicações de choque elétrico não específicas.
Introduction
Investigações iniciais da dinâmica espaço-temporal durante a arritmia revelaram que os complexos padrões elétricos durante a fibrilação cardíaca são impulsionados por ondas de excitação rotativas semelhantes a vórtices1. Esse achado deu novos insights sobre os mecanismos subjacentes das arritmias, o que levou ao desenvolvimento de novas terapias de terminação elétrica baseadas na excitação multissítio do miocárdio 2,3,4. No entanto, os tratamentos que utilizam estimulação elétrica de campo não são locais e podem inervar todas as células excitáveis circundantes, incluindo o tecido muscular, causando danos celulares e teciduais, bem como dor intolerável. Em contraste com as terapias elétricas, as abordagens optogenéticas fornecem uma técnica específica e protetora dos tecidos para evocar potenciais de ação de cardiomiócitos com alta precisão espacial e temporal. Portanto, a estimulação optogenética tem o potencial de controle invasivo mínimo dos padrões de ativação caótica durante a fibrilação cardíaca.
A introdução do canal iônico sensível à luz canalrodopsina-2 (ChR2) em células excitáveis via manipulação genética 5,6,7, possibilitou a despolarização do potencial de membrana de células excitáveis por meio da fotoestimulação. Várias aplicações médicas, incluindo a ativação de redes neuronais, o controle da atividade cardíaca, a restauração da visão e da audição, o tratamento de lesões medulares e outras 8,9,10,11,12,13,14 têm sido desenvolvidas. A aplicação da ChR2 em cardiologia tem potencial significativo devido ao seu tempo de resposta de milissegundos15, tornando-a adequada para o controle direcionado da dinâmica cardíaca arrítmica.
Neste estudo, a fotoestimulação multi-local de corações intactos de um modelo de rato transgênico é mostrada. Em resumo, foi criada uma linha de ratinhos alfa-MHC-ChR2 transgénicos no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) e gentilmente fornecida pelo Prof. S. E. Lehnart. Em geral, machos adultos transgênicos C57/B6/J, expressando Cre-recombinase sob controle de alfa-MHC foram pareados para acasalar com fêmeas B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Como o STOP cardíaco foi apagado na segunda geração, a prole apresentou expressão estável de MHC-ChR2 e foi utilizada para manter colônias fotossensíveis cardíacas. Todos os experimentos foram feitos com camundongos adultos de ambos os sexos com uma idade de 36 a 48 semanas. A iluminação é obtida usando uma matriz de micro-LED 3 x 3, fabricada conforme descrito em16,17, exceto que o invólucro à base de silício e as fibras de vidro ópticas curtas não são implementados. Seu primeiro uso em uma aplicação cardíaca é encontrado em18. Uma matriz linear de micro-LED baseada em uma tecnologia de fabricação semelhante foi aplicada como uma sonda penetrante para o ritmo cardíaco19. Os micro-LEDs são dispostos em uma matriz 3 x 3 a um passo de 550 μm, proporcionando uma alta resolução espacial e uma alta potência radiante em uma área muito pequena. Os autores demonstram neste trabalho uma fotoestimulação multissítio local versátil que pode abrir caminho para o desenvolvimento de novos métodos de terapia antiarrítmica.
O protocolo experimental a seguir envolve uma perfusão retrógrada de Langendorff ex vivo, para a qual a aorta canulada funciona como entrada de perfusão. Devido à pressão de perfusão aplicada e à contração cardíaca, o perfusato está fluindo através das artérias coronárias, que se ramificam da aorta. No trabalho apresentado, o coração é perfundido utilizando-se uma configuração de pressão constante alcançada pela elevação dos reservatórios de perfusato a 1 m de altura, equivalente a 73,2 mmHg, o que resulta em uma vazão de 2,633 ± 0,583 mL/min. Dois tipos de solução de Tyrode’s são usados como perfusato durante o experimento. A solução de Tyrode regular suporta um ritmo sinusal estável, enquanto a solução de Tyrode Low-K+ é misturada com Pinacidil para permitir a indução de arritmia em corações murinos. O uso de um banho-maria hexagonal permite a observação do coração através de seis janelas planares diferentes, permitindo o acoplamento de vários componentes ópticos com menor distorção por refração.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um tratamento bem-sucedido das taquiarritmias cardíacas é fundamental para a terapia cardíaca. No entanto, os mecanismos biofísicos subjacentes ao início, perpetuação e término da arritmia não são totalmente compreendidos. Portanto, a pesquisa cardíaca visa otimizar a terapia de choque elétrico para uma terminação mais suave das arritmias, aumentando assim a qualidade de vida dos pacientes 28,29,30,31.<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Marion Kunze e Tina Althaus por seu excelente suporte técnico durante os experimentos. A investigação que conduziu aos resultados recebeu financiamento do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia FP7/2007-2013 ao abrigo da convenção de subvenção número HEALTH-F2-2009-241526. O apoio também foi fornecido pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular, DZHK e.V. (Projeto MD28), site parceiro Goettingen, a Fundação Alemã de Pesquisa CRC 1002 (projeto C03) e a Sociedade Max Planck. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG, número de concessão EXC 1086).
Materials
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
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