Summary

Avanceret hjerterytmestyring ved anvendelse af optogenetisk multi-site fotostimulation i Murine Hearts

Published: August 26, 2021
doi:

Summary

Dette arbejde rapporterer en metode til styring af hjerterytmen hos intakte murinhjerter hos transgene channelrhodopsin-2 (ChR2) mus ved hjælp af lokal fotostimulation med et mikro-LED-array og samtidig optisk kortlægning af epikardiemembranpotentiale.

Abstract

Ventrikulær takyarytmier er en væsentlig årsag til dødelighed og sygelighed over hele verden. Elektrisk defibrillering ved hjælp af elektriske stød med høj energi er i øjeblikket den eneste behandling for livstruende ventrikelflimmer. Defibrillering kan dog have bivirkninger, herunder utålelig smerte, vævsskade og forværring af prognosen, hvilket indikerer et betydeligt medicinsk behov for udvikling af mere blide hjerterytmestyringsstrategier. Udover energireducerende elektriske tilgange blev hjerteoptogenetik introduceret som et kraftfuldt værktøj til at påvirke hjerteaktivitet ved hjælp af lysfølsomme membranionkanaler og lysimpulser. I denne undersøgelse vil en robust og gyldig metode til vellykket fotostimulation af Langendorff perfunderede intakte murinehjerter blive beskrevet baseret på multi-site pacing ved anvendelse af en 3 x 3 række mikrolysemitterende dioder (mikro-LED). Samtidig optisk kortlægning af epikardiale membranspændingsbølger gør det muligt at undersøge virkningerne af regionsspecifik stimulering og evaluerer den nyligt inducerede hjerteaktivitet direkte på stedet. De opnåede resultater viser, at effekten af defibrillering er stærkt afhængig af de parametre, der er valgt til fotostimulation under en hjertearytmi. Det vil blive demonstreret, at det belyste område af hjertet spiller en afgørende rolle for afslutning succes samt hvordan den målrettede kontrol af hjerteaktivitet under belysning til ændring af arytmi mønstre kan opnås. Sammenfattende giver denne teknik mulighed for at optimere mekanismemanipulationen på stedet på vej til realtidsfeedbackkontrol af hjerterytmen og, hvad angår regionens specificitet, nye tilgange til at reducere den potentielle skade på hjertesystemet sammenlignet med brugen af ikke-specifikke elektriske stødapplikationer.

Introduction

Tidlige undersøgelser af den rumlige-temporale dynamik under arytmi afslørede, at de komplekse elektriske mønstre under hjerteflimmer drives af hvirvellignende roterende excitationsbølger1. Dette fund gav ny indsigt i de underliggende mekanismer for arytmier, som derefter førte til udviklingen af nye elektriske termineringsterapier baseret på multi-site excitation af myokardiet 2,3,4. Imidlertid er behandlinger ved hjælp af elektrisk feltstimulering ikke-lokale og kan innervere alle omgivende excitable celler, herunder muskelvæv, hvilket forårsager cellulær og vævsskade samt uacceptabel smerte. I modsætning til elektriske terapier giver optogenetiske tilgange en specifik og vævsbeskyttende teknik til fremkaldelse af kardiomyocythandlingspotentialer med høj rumlig og tidsmæssig præcision. Derfor har optogenetisk stimulering potentialet for minimal invasiv kontrol af de kaotiske aktiveringsmønstre under hjerteflimmer.

Introduktionen af den lysfølsomme ionkanal channelrhodopsin-2 (ChR2) i excitable celler via genetisk manipulation 5,6,7 muliggjorde depolarisering af membranpotentialet i excitable celler ved hjælp af fotostimulation. Flere medicinske anvendelser, herunder aktivering af neuronale netværk, kontrol af hjerteaktivitet, genoprettelse af syn og hørelse, behandling af rygmarvsskader og andre 8,9,10,11,12,13,14 er blevet udviklet. Anvendelsen af ChR2 i kardiologi har et betydeligt potentiale på grund af dets millisekunders responstid15, hvilket gør det velegnet til målrettet kontrol af arytmisk hjertedynamik.

I denne undersøgelse vises multi-site fotostimulation af intakte hjerter af en transgen musemodel. Sammenfattende blev der oprettet en transgen alfa-MHC-ChR2-muselinje inden for rammerne af Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) og venligst leveret af prof. S. E. Lehnart. Generelt blev transgene voksne hanner C57/B6/J, der udtrykker Cre-rekombinase under kontrol af alfa-MHC, parret med at parre sig med hunnen B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Da hjertets STOP-kassette blev slettet i anden generation, viste afkomene et stabilt MHC-ChR2-udtryk og blev brugt til at opretholde hjertelysfølsomme kolonier. Alle forsøg blev udført med voksne mus af begge køn i en alder af 36 – 48 uger. Belysningen opnås ved hjælp af et 3 x 3 mikro-LED-array, fremstillet som beskrevet i16,17, bortset fra at det siliciumbaserede hus og de korte optiske glasfibre ikke er implementeret. Dens første anvendelse i en hjerteapplikation findes i18. Et lineært mikro-LED-array baseret på en lignende fabrikationsteknologi er blevet anvendt som en penetrerende sonde til hjertetempo19. Mikro-LED’erne er arrangeret i et 3 x 3 array med en stigning på 550 μm, hvilket giver både en høj rumlig opløsning og en høj strålingseffekt på et meget lille område. Forfatterne demonstrerer i dette arbejde en alsidig lokal multi-site fotostimulation, der kan åbne vejen for udvikling af nye anti-arytmiske terapimetoder.

Følgende forsøgsprotokol involverer en retrograd Langendorff perfusion ex vivo, for hvilken den kannelerede aorta fungerer som perfusionsindløb. På grund af det påførte perfusionstryk og hjertekontraktionen strømmer perfusatet gennem koronararterierne, som forgrener sig fra aorta. I det præsenterede arbejde perfunderes hjertet ved hjælp af en konstant trykopsætning opnået ved at hæve perfusatreservoirerne til 1 m højde, svarende til 73,2 mmHg, hvilket giver en strømningshastighed på 2,633 ± 0,583 ml / min. To slags Tyrodes opløsning anvendes som perfusat under eksperimentet. Regelmæssig tyrodes opløsning understøtter en stabil sinusrytme, mens Low-K + Tyrodes opløsning blandes med Pinacidil for at muliggøre induktion af arytmi i murinhjerter. Brugen af et sekskantet vandbad tillader observation af hjertet gennem seks forskellige plane vinduer, hvilket muliggør kobling af flere optiske komponenter med mindre forvrængning ved brydning.

Protocol

Alle forsøg fulgte nøje dyrevelfærdsforordningen i overensstemmelse med tysk lovgivning, lokale bestemmelser og i overensstemmelse med anbefalinger fra Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Ansøgningen om godkendelse af dyreforsøg er godkendt af den ansvarlige dyrevelfærdsmyndighed, og alle forsøg blev rapporteret til vores dyrevelfærdsrepræsentanter. 1. Eksperimentforberedelse og materialer Opsætning af optisk kortlægningBEMÆRK: Den …

Representative Results

Protokollen tillader induktion af ventrikulære arytmier i intakte murinehjerter ved hjælp af fotostimulationsimpulser genereret af LED 1 og LED 2 (figur 1) med en frekvens f ind mellem 25 Hz og 35 Hz og en pulsvarighed Wind mellem 2 ms og 10 ms. Bemærk, at formålet med sådanne hurtige lysimpulser ikke er at fange hjerterytmen, men snarere at afbalancere hjerteaktiviteten, så uberegnelige elektriske bølger kan genereres, som derefter letter en arytmi. Fordelen ved…

Discussion

En vellykket behandling af hjertetakyarytmier er nøglen til hjerteterapi. Imidlertid er de biofysiske mekanismer, der ligger til grund for arytmiinitiering, fortsættelse og afslutning, ikke fuldt ud forstået. Derfor sigter hjerteforskning mod at optimere elektrisk stødterapi mod en mere skånsom afslutning af arytmier og derved øge patienternes livskvalitet 28,29,30,31. Lavenergi elektrisk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Marion Kunze og Tina Althaus for deres fremragende tekniske support under eksperimenter. Den forskning, der har ført til resultaterne, har modtaget støtte fra Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram FP7/2007-2013 under tilskudsaftale nummer HEALTH-F2-2009-241526. Der blev også ydet støtte fra det tyske center for kardiovaskulær forskning, DZHK e.V. (projekt MD28), partnersiden Goettingen, den tyske forskningsfond CRC 1002 (projekt C03) og Max Planck Society. Dette arbejde blev delvist støttet af BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence finansieret af den tyske forskningsfond (DFG, bevillingsnummer EXC 1086).

Materials

Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25×36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light – From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. . mouser.de, LED Engin, [Online] Available from: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208 (2020)
  21. . thorlabs.com, thorlabs, [Online] Available from: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020)
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O’Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping – Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).
check_url/62335?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

View Video