Dette arbejde rapporterer en metode til styring af hjerterytmen hos intakte murinhjerter hos transgene channelrhodopsin-2 (ChR2) mus ved hjælp af lokal fotostimulation med et mikro-LED-array og samtidig optisk kortlægning af epikardiemembranpotentiale.
Ventrikulær takyarytmier er en væsentlig årsag til dødelighed og sygelighed over hele verden. Elektrisk defibrillering ved hjælp af elektriske stød med høj energi er i øjeblikket den eneste behandling for livstruende ventrikelflimmer. Defibrillering kan dog have bivirkninger, herunder utålelig smerte, vævsskade og forværring af prognosen, hvilket indikerer et betydeligt medicinsk behov for udvikling af mere blide hjerterytmestyringsstrategier. Udover energireducerende elektriske tilgange blev hjerteoptogenetik introduceret som et kraftfuldt værktøj til at påvirke hjerteaktivitet ved hjælp af lysfølsomme membranionkanaler og lysimpulser. I denne undersøgelse vil en robust og gyldig metode til vellykket fotostimulation af Langendorff perfunderede intakte murinehjerter blive beskrevet baseret på multi-site pacing ved anvendelse af en 3 x 3 række mikrolysemitterende dioder (mikro-LED). Samtidig optisk kortlægning af epikardiale membranspændingsbølger gør det muligt at undersøge virkningerne af regionsspecifik stimulering og evaluerer den nyligt inducerede hjerteaktivitet direkte på stedet. De opnåede resultater viser, at effekten af defibrillering er stærkt afhængig af de parametre, der er valgt til fotostimulation under en hjertearytmi. Det vil blive demonstreret, at det belyste område af hjertet spiller en afgørende rolle for afslutning succes samt hvordan den målrettede kontrol af hjerteaktivitet under belysning til ændring af arytmi mønstre kan opnås. Sammenfattende giver denne teknik mulighed for at optimere mekanismemanipulationen på stedet på vej til realtidsfeedbackkontrol af hjerterytmen og, hvad angår regionens specificitet, nye tilgange til at reducere den potentielle skade på hjertesystemet sammenlignet med brugen af ikke-specifikke elektriske stødapplikationer.
Tidlige undersøgelser af den rumlige-temporale dynamik under arytmi afslørede, at de komplekse elektriske mønstre under hjerteflimmer drives af hvirvellignende roterende excitationsbølger1. Dette fund gav ny indsigt i de underliggende mekanismer for arytmier, som derefter førte til udviklingen af nye elektriske termineringsterapier baseret på multi-site excitation af myokardiet 2,3,4. Imidlertid er behandlinger ved hjælp af elektrisk feltstimulering ikke-lokale og kan innervere alle omgivende excitable celler, herunder muskelvæv, hvilket forårsager cellulær og vævsskade samt uacceptabel smerte. I modsætning til elektriske terapier giver optogenetiske tilgange en specifik og vævsbeskyttende teknik til fremkaldelse af kardiomyocythandlingspotentialer med høj rumlig og tidsmæssig præcision. Derfor har optogenetisk stimulering potentialet for minimal invasiv kontrol af de kaotiske aktiveringsmønstre under hjerteflimmer.
Introduktionen af den lysfølsomme ionkanal channelrhodopsin-2 (ChR2) i excitable celler via genetisk manipulation 5,6,7 muliggjorde depolarisering af membranpotentialet i excitable celler ved hjælp af fotostimulation. Flere medicinske anvendelser, herunder aktivering af neuronale netværk, kontrol af hjerteaktivitet, genoprettelse af syn og hørelse, behandling af rygmarvsskader og andre 8,9,10,11,12,13,14 er blevet udviklet. Anvendelsen af ChR2 i kardiologi har et betydeligt potentiale på grund af dets millisekunders responstid15, hvilket gør det velegnet til målrettet kontrol af arytmisk hjertedynamik.
I denne undersøgelse vises multi-site fotostimulation af intakte hjerter af en transgen musemodel. Sammenfattende blev der oprettet en transgen alfa-MHC-ChR2-muselinje inden for rammerne af Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) og venligst leveret af prof. S. E. Lehnart. Generelt blev transgene voksne hanner C57/B6/J, der udtrykker Cre-rekombinase under kontrol af alfa-MHC, parret med at parre sig med hunnen B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Da hjertets STOP-kassette blev slettet i anden generation, viste afkomene et stabilt MHC-ChR2-udtryk og blev brugt til at opretholde hjertelysfølsomme kolonier. Alle forsøg blev udført med voksne mus af begge køn i en alder af 36 – 48 uger. Belysningen opnås ved hjælp af et 3 x 3 mikro-LED-array, fremstillet som beskrevet i16,17, bortset fra at det siliciumbaserede hus og de korte optiske glasfibre ikke er implementeret. Dens første anvendelse i en hjerteapplikation findes i18. Et lineært mikro-LED-array baseret på en lignende fabrikationsteknologi er blevet anvendt som en penetrerende sonde til hjertetempo19. Mikro-LED’erne er arrangeret i et 3 x 3 array med en stigning på 550 μm, hvilket giver både en høj rumlig opløsning og en høj strålingseffekt på et meget lille område. Forfatterne demonstrerer i dette arbejde en alsidig lokal multi-site fotostimulation, der kan åbne vejen for udvikling af nye anti-arytmiske terapimetoder.
Følgende forsøgsprotokol involverer en retrograd Langendorff perfusion ex vivo, for hvilken den kannelerede aorta fungerer som perfusionsindløb. På grund af det påførte perfusionstryk og hjertekontraktionen strømmer perfusatet gennem koronararterierne, som forgrener sig fra aorta. I det præsenterede arbejde perfunderes hjertet ved hjælp af en konstant trykopsætning opnået ved at hæve perfusatreservoirerne til 1 m højde, svarende til 73,2 mmHg, hvilket giver en strømningshastighed på 2,633 ± 0,583 ml / min. To slags Tyrodes opløsning anvendes som perfusat under eksperimentet. Regelmæssig tyrodes opløsning understøtter en stabil sinusrytme, mens Low-K + Tyrodes opløsning blandes med Pinacidil for at muliggøre induktion af arytmi i murinhjerter. Brugen af et sekskantet vandbad tillader observation af hjertet gennem seks forskellige plane vinduer, hvilket muliggør kobling af flere optiske komponenter med mindre forvrængning ved brydning.
En vellykket behandling af hjertetakyarytmier er nøglen til hjerteterapi. Imidlertid er de biofysiske mekanismer, der ligger til grund for arytmiinitiering, fortsættelse og afslutning, ikke fuldt ud forstået. Derfor sigter hjerteforskning mod at optimere elektrisk stødterapi mod en mere skånsom afslutning af arytmier og derved øge patienternes livskvalitet 28,29,30,31. Lavenergi elektrisk…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Marion Kunze og Tina Althaus for deres fremragende tekniske support under eksperimenter. Den forskning, der har ført til resultaterne, har modtaget støtte fra Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram FP7/2007-2013 under tilskudsaftale nummer HEALTH-F2-2009-241526. Der blev også ydet støtte fra det tyske center for kardiovaskulær forskning, DZHK e.V. (projekt MD28), partnersiden Goettingen, den tyske forskningsfond CRC 1002 (projekt C03) og Max Planck Society. Dette arbejde blev delvist støttet af BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence finansieret af den tyske forskningsfond (DFG, bevillingsnummer EXC 1086).
Chemical Components | |||
Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
Electrical Setup | |||
Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
Hexagonal water bath | |||
LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
micro-LED Array Components | |||
Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
Optical Mapping | |||
Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |