DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen

Summary

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von DNA-basierten Spannungssonden beschrieben, um die von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte abzubilden. Dieser Ansatz kann Rezeptorkräfte >4,7 pN in Echtzeit abbilden und Kräfte über die Zeit integrieren.

Abstract

Mechanische Kräfte, die an der Verbindungsstelle zwischen zwei benachbarten Zellen und an der Verbindungsstelle zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix übertragen werden, sind entscheidend für die Regulierung vieler Prozesse, die von der Entwicklung bis zur Immunologie reichen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Werkzeuge zu entwickeln, um diese Kräfte auf molekularer Ebene zu untersuchen. Unsere Gruppe entwickelte eine Reihe von molekularen Spannungssensoren, um die von Zellen erzeugten und auf bestimmte Liganden übertragenen Kräfte zu quantifizieren und zu visualisieren. Die empfindlichste Klasse von molekularen Spannungssensoren besteht aus Nukleinsäure-Stammschleifen-Haarnadeln. Diese Sensoren verwenden Fluorophor-Quencher-Paare, um die mechanische Dehnung und Entfaltung von DNA-Haarnadeln unter Krafteinwirkung zu melden. Eine Herausforderung bei DNA-Hairpin-Spannungssensoren besteht darin, dass sie reversibel sind, wobei die Hairpin-Spannung beim Beenden der Spannung schnell zurückgefaltet werden kann und somit transiente Kräfte schwer zu erfassen sind. In diesem Artikel beschreiben wir die Protokolle zur Herstellung von DNA-Spannungssensoren, die “verriegelt” und am erneuten Falten gehindert werden können, um das “Speichern” mechanischer Informationen zu ermöglichen. Dies ermöglicht die Aufzeichnung von hochtransienten Piconewton-Kräften, die anschließend durch die Zugabe komplementärer Nukleinsäuren, die die Sperre entfernen, “gelöscht” werden können. Diese Fähigkeit, zwischen Echtzeit-Spannungsmapping und mechanischer Informationsspeicherung umzuschalten, offenbart schwache, kurzlebige und weniger reichlich vorhandene Kräfte, die von T-Zellen üblicherweise als Teil ihrer Immunfunktionen eingesetzt werden.

Introduction

Immunzellen wehren sich gegen Krankheitserreger und Krebszellen, indem sie kontinuierlich die Oberflächen von Zielzellen nach Antigenen durchsuchen und deren Oberfläche abtasten ^1,2. Die Antigenerkennung wird durch die Bindung zwischen dem T-Zell-Rezeptor (TCR) und dem Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex MHC (pMHC) eingeleitet, der auf der Oberfläche der Zielzellen exprimiert wird. Da die TCR-pMHC-Erkennung an der Verbindungsstelle zwischen zwei beweglichen Zellen erfolgt, steht sie seit langem im Verdacht, mechanische Kräfte zu erfahren. Darüber hinaus führte dies zum Mechanosensormodell der TCR-Aktivierung, das darauf hindeutet, dass TCR-Kräfte zu seiner Funktion beitragen ^3,4. Um zu verstehen, wann, wo und wie mechanische Kräfte zur Funktion von T-Zellen beitragen, ist es unerlässlich, Werkzeuge zu entwickeln, um die von T-Zellen übertragenen molekularen Kräfte sichtbar zu machen. Traditionell werden Methoden wie Zugkraftmikroskopie (TFM) und Mikrosäulen-Arrays verwendet, um zelluläre Kräfte zu untersuchen ^5,6. Die Kraftempfindlichkeit von TFM- und Mikrosäulen-Arrays liegt jedoch im Nanonewton (nN)-Bereich und reicht daher oft nicht aus, um die molekularen Piconewton (pN)-Kräfte zu untersuchen, die von Zellrezeptoren übertragen^{werden 7}. Um die Kraft und die räumliche Auflösung für die Detektion zu verbessern, leistete unser Labor Pionierarbeit bei der Entwicklung von molekularen Spannungssonden, die ursprünglich mit Polyethylenglykol (PEG)-Polymeren synthetisiert wurden⁷. Molekulare Spannungssonden bestehen aus einer ausziehbaren molekularen “Feder” (PEG, Protein, DNA), die von einem Fluorophor und Quencher flankiert wird und auf einer Oberfläche verankert ist. Kräfte, die auf den Endpunkt der Sonde ausgeübt werden, führen zu ihrer Verlängerung, trennen Fluorophor und Quencher und erzeugen so ein starkes Fluoreszenzsignal (Abbildung 1A)^8,9,10.

In den letzten zehn Jahren haben wir eine Bibliothek verschiedener Klassen von molekularen Zugsonden mit Federelementen aus Nukleinsäuren¹¹, Proteinen¹⁰ und Polymeren⁸ entwickelt. Unter diesen bieten die DNA-basierten Zugsonden das höchste Signal-Rausch-Verhältnis und die größte Kraftempfindlichkeit, die leicht von wenigen pN bis zu ~20 pN¹¹ eingestellt werden kann. Wir haben diese Echtzeit-DNA-Spannungssonden verwendet, um die molekularen Kräfte zu untersuchen, die von vielen verschiedenen Zelltypen erzeugt werden, darunter Fibroblasten, Krebszellen, Blutplättchen und Immunzellen^11,12,13. In diesem Manuskript werden Protokolle zur Synthese und Montage von DNA-Zugsonden auf einer Oberfläche beschrieben, um molekulare Rezeptorkräfte mit pN-Kraftauflösung unter Verwendung eines konventionellen Fluoreszenzmikroskops abzubilden. Während das derzeitige Verfahren chemische Modifikationen der Nukleinsäure umfasst, um den fluoreszierenden Reporter einzuführen (Abbildung 1B), ist es wichtig zu beachten, dass viele der Modifikations- und Aufreinigungsschritte an kundenspezifische DNA-Syntheseunternehmen ausgelagert werden können. Daher ist die Technologie der DNA-Spannungssonden einfach und für die breitere Gemeinschaft der Zellbiologie und Mechanobiologie zugänglich.

Kurz gesagt, um DNA-Spannungssensoren zusammenzubauen, wird eine DNA-Haarnadel mit einem fluoreszierenden Ligandenstrang auf einem Arm und einem Quencher-Ankerstrang auf dem anderen Arm hybridisiert und dann auf einem Glassubstrat immobilisiert (Abbildung 1C, Echtzeitspannung). In Abwesenheit einer mechanischen Kraft wird die Haarnadel geschlossen und somit die Fluoreszenz gelöscht. Wenn jedoch die ausgeübte mechanische Kraft größer als F_1/2 ist (die Kraft im Gleichgewicht, die zu einer 50%igen Wahrscheinlichkeit der Entfaltung führt), schmilzt die Haarnadel mechanisch und es wird ein fluoreszierendes Signal erzeugt.

Aufbauend auf dem Echtzeit-DNA-Spannungssensor beschreiben wir auch Protokolle zur Kartierung akkumulierter Kräfte, was besonders nützlich ist, um Interaktionen zwischen Rezeptoren auf Immunzellen und ihrem natürlichen Liganden zu untersuchen. Dies liegt daran, dass Immunrezeptoren oft kurzlebige Bindungen aufweisen ^3,14. Die akkumulierten Kräfte werden mit einem “verriegelnden” Strang abgebildet, der bevorzugt an offene DNA-Haarnadeln bindet und die Speicherung von Fluoreszenzsignalen ermöglicht, die mit mechanischen Zugereignissen verbunden sind (Abbildung 1C, verriegelte Spannung). Der Verriegelungsstrang ist so konzipiert, dass er eine kryptische Bindungsstelle bindet, die beim mechanisch induzierten Schmelzen der Haarnadel freigelegt wird, und die Haarnadel im offenen Zustand sperrt, indem er die Rückfaltung der Haarnadel blockiert, wodurch das Spannungssignal gespeichert und eine akkumulierte Spannungskarte erzeugt wird. Darüber hinaus ist der Locking-Strang mit einem Acht-Nukleotid-Zehengriff ausgelegt, der eine Zehengriff-vermittelte Strangverdrängungsreaktion mit seinem vollständigen Komplement, dem “entsperrenden” Strang, ermöglicht. Durch das Hinzufügen des Entriegelungsstrangs wird der gebundene Verriegelungsstrang vom Hairpin-Konstrukt abgestreift, wodurch das gespeicherte Spannungssignal gelöscht und der Hairpin wieder in den Echtzeitzustand zurückgesetzt wird.

Abbildung 1: Schema der hochmodernen molekularen Spannungssonden. (A) Allgemeines Design einer Echtzeit-Molekularspannungssonde, (B) Stränge für das DNA-basierte Spannungssondenkonstrukt und (C) DNA-basierte Spannungssonden und deren Umschalten zwischen Echtzeitzustand und verriegeltem Zustand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Das Hauptprotokoll besteht aus vier Hauptabschnitten – Oligonukleotidpräparation, Oberflächenpräparation, Bildgebung und Datenanalyse. Dieses Protokoll wurde von unserem Labor und anderen erfolgreich in naiven und aktivierten OT-1 CD8+ T-Zellen, OT-II CD4⁺ Zellen sowie Hybridomen demonstriert und kann angewendet werden, um verschiedene Immunzellrezeptoren zu untersuchen, einschließlich des T-Zell-Rezeptors, des programmierten Zelltodrezeptors (PD1) und der Lymphozytenfunktions-assoziierten Antigen-1-Kräfte (LFA-1). OT-1 CD8⁺ naive T-Zellen werden in dieser Arbeit als Beispielzelllinie verwendet.

Protocol

Die transgenen OT-1-Mäuse sind in der Division of Animal Resources Facility der Emory University untergebracht. Alle Experimente wurden nach dem Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und durchgeführt. 1. Herstellung von Oligonukleotiden Lösen Sie die DNA des Ligandenstrangs in Wasser auf (18,2 MΩ Widerstand, der im gesamten Protokoll verwendet wird). Vortexieren und schleudern Sie die Lösung mit einer Tischzentrifuge herunter. Stellen Sie da…

Representative Results

Hier zeigen wir repräsentative Bilder zur Kontrolle der Oberflächenqualität (Abbildung 4). Eine hochwertige Oberfläche sollte einen sauberen Hintergrund im RICM-Kanal (Abbildung 4B) und eine gleichmäßige Fluoreszenzintensität im Cy3B-Kanal (Abbildung 4C) aufweisen. Bei gleichen bildgebenden Geräten und identischen Aufnahmebedingungen für die Fluoreszenzbildgebung sollte die Hintergrundfluoreszenzintensität bei der Durchfü…

Discussion

Mit den hier vorgestellten detaillierten Verfahren kann man DNA-Haarnadel-Spannungssondensubstrate herstellen, um die von Immunzellen produzierte Rezeptorspannung zu kartieren und zu quantifizieren. Wenn Zellen auf das Substrat der DNA-Haarnadel-Spannungssonde plattiert werden, landen, heften sie sich an und breiten sich aus, während die Rezeptoren die Liganden sowohl chemisch als auch mechanisch wahrnehmen, wobei letzteres von unseren Sonden erkannt wird. In einigen Fällen kann es jedoch vorkommen, dass sich die Zelle…

Materials

3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)	Sigma	56197	maldi-TOF-MS matrix
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	surface prep
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Acros	AC430941000	surface prep
10x Red blood cell lysis buffer	Biolegend	00-4333-57	buffer
8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid	Nanocomposix	customized order	surface prep
Atto647N NHS ester	Sigma	18373-1MG-F	fluorophore, oligo prep
Attofluor Cell Chamber, for microscopy	Thermo Fisher Scientific	A7816	imaging
BD Syringes only with Luer-Lok	BD bioscience	309657	cells
biotinylated anti-mouse CD3e	ebioscience	13-0031-82	antibody/ligand
Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)	NIH Tetramer Core Facility at Emory University	NA	antibody/ligand
bovine serum albumin	Sigma	735078001	block non-specific interactions
Cell strainers	Biologix	15-1100	cells
Coverslip Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Scientific	C14784	surface prep
Cy3B NHS ester	GE Healthcare	PA63101	fluorophore, oligo prep
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CM	buffer
ethanol	Sigma	459836	surface prep
Hank’s balanced salts (HBSS)	Sigma	H8264	buffer
hydrogen peroxide	Sigma	H1009	surface prep
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3.4K	surface prep
Midi MACS (LS) startup kit	Miltenyi Biotec	130-042-301	cells
mouse CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-104-075	cells
Nanosep MF centrifugal devices	Pall laboratory	ODM02C35	oligo prep
No. 2 round glass coverslips	VWR	48382-085	surface prep
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	N475-10	surface prep
P2 gel	Bio-rad	1504118	oligo prep
sufuric acid	EMD Millipore Corporation	SX1244-6	surface prep
Sulfo-NHS acetate	Thermo Fisher Scientific	26777	surface prep
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm	653950-702		oligonucleotide preparation
Barnstead Nanopure water purifying system	Thermo Fisher		water
CFI Apo 100× NA 1.49 objective	Nikon		Microscopy
Cy5 cube	CHROMA		Microscopy
evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)	Photometrics		Microscopy
High-performance liquid chromatography	Agilent 1100		oligonucleotide preparation
Intensilight epifluorescence source	Nikon		Microscopy
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		oligonucleotide preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher		oligonucleotide preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope	Nikon		Microscopy
Nikon Perfect Focus System	Nikon		Microscopy
NIS Elements software	Nikon		Microscopy
quad band TIRF 405/488/561/647 cube	CHROMA		Microscopy
RICM cube	CHROMA		Microscopy
TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm	Coherent		Microscopy
TRITC cube	CHROMA		Microscopy
oligo name	5' modification / 3' modification	sequence (5' to 3')	Use
15mer amine locking strand	5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer Atto647N locking strand	5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer non-fluoresccent locking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	A AAA AAC ATT TAT AC	locking real-time tension signal for quantitative analysis
4.7 pN hairpin strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	hairpin probe
amine ligand strand	5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
BHQ2 anchor strand	5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	hairpin probe
Cy3B ligand strand	5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
unlocking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	unlocking accumulated tension signal