Denne protokol beskriver proceduren for fjernelse af leverens ventral lap hos voksne zebrafisk for at gøre det muligt at studere leverregenerering.
Leversvigt er en af de førende dødsårsager på verdensplan, og dødeligheden fra kronisk leversygdom stiger kraftigt i USA. Sunde lever er i stand til at regenerere fra giftige skader, men i fremskreden leversygdom er leverens naturlige evne til at regenerere nedsat. Zebrafisk er opstået som et stærkt eksperimentelt system til at studere regenerering. De er en ideel model til at studere leverregenerering fra delvis hepatektomi, en procedure med direkte klinisk relevans, hvor en del af leveren fjernes kirurgisk, hvilket efterlader resten intakt. Der er ingen standardprotokol for delvis hepatektomi. tidligere undersøgelser ved hjælp af denne model har brugt lidt forskellige protokoller og rapporteret forskellige resultater. Beskrevet her er en effektiv, reproducerbar protokol til udførelse af en delvis hepatektomi hos voksne zebrafisk. Vi bruger denne teknik til at demonstrere, at zebrafisk er i stand til epimorf regenerering af den resected lap. Denne protokol kan bruges til yderligere at afhøre de mekanismer, der kræves for leverregenerering i zebrafisk.
Blandt de faste organer hos mennesker er leveren det eneste organ, der er i stand til regenerering1. Dette er kritisk, da leveren er et vigtigt organ, der er ansvarlig for vigtige metaboliske funktioner, energilagring, blod afgiftning, sekretion af plasmaproteiner og galdeproduktion2. Hepatocytter tabt på grund af giftige eller inflammatoriske skader erstattes primært via opdeling af de resterende hepatocytter1. En klassisk eksperimentel model til undersøgelse af leverregenerering er delvis hepatektomi, hvor individuelle lobes af leveren fjernes, hvilket efterlader de resterende lobesintakte 3. Denne procedure blev oprindeligt udviklet hos rotter, hvor ca. to tredjedele af levermassen fjernes. Efter delvis hepatektomi hos pattedyr forekommer kompenserende regenerering i de resterende lobes, indtil leveren genvinder sin oprindelige masse. Især erstatter pattedyrsleveren ikke de manglende lobes.
Zebrafisk (Danio rerio) repræsenterer en tractable model for at studere voksen organ regenerering4. Zebrafiskleveren, mens den er strukturelt forskellig fra pattedyrsleveren, består af de samme celletyper og tjener den samme funktion som hos pattedyr2. Det er sammensat af tre lapper, med to dorsale lobes og en enkelt ventral lap, der er fladt langs tarmen. Delvis hepatektomi er tidligere blevet udført i zebrafisk, med modstridende beretninger om den præcise form for regenerering. Typisk udføres en tredjedel delvis hepatektomi ved fjernelse af hele ventral lap. Indledende rapporter viste, at efter fjernelse af ventral lapen var den fuldt regenereret inden for en uge5,6,7, hvilket tyder på, at zebrafiskleveren i modsætning til pattedyrsleveren er i stand til epimorf regenerering. Efterfølgende undersøgelser viste , at fjernelse af ventral lap resulterede i kompenserende regenerering i dorsale lobes, snarere end regenerering af den manglende ventral lap, og i sidste ende inddrivelse af levermasse inden for en uge8,9. Transskriptionsprofilering af dorsale lobes efter resektion af ventral lap afslørede betydelige ændringer forbundet med kompenserende regenerering10. I betragtning af at tilstanden af leverregenerering kan variere med omfanget af skaden8, spekulerede vi på, at forskellene i resultaterne kan skyldes teknisk variation i den delvise hepatektomiprotokol mellem forskningsgrupper.
Denne protokol beskriver en procedure for udførelse af en tredjedel delvis hepatektomi på voksne zebrafisk ved at fjerne ventral lap. Denne teknik vil være værdifuld til vurdering af mekanismer til leverregenerering.
De anatomiske forskelle mellem zebrafisk og pattedyr modeller for lever regenerering udgør unikke udfordringer for lever resektion. Leveren i zebrafisk er tæt på hjertet og tarmen; utilsigtet skadelige begge organer resulterer i øget dødelighed. Zebrafiskleveren er ikke indkapslet, hvilket gør det vanskeligere at adskille fra tarmen. Leveren modtager næringsrige blod fra tarmen gennem portal vener. Hos pattedyr konvergerer vener, der forlader tarmen, på en primær portalåre, der derefter opdeles, når den kommer…
The authors have nothing to disclose.
I.M.O. understøttes af NIAAA (F32AA027135). W.G. understøttes af R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 og Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. er en Pew Scholar i biomedicinsk videnskab.
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |