Hepatectomía parcial en pez cebra adulto
Summary
Este protocolo describe el procedimiento para eliminar el lóbulo ventral del hígado en el pez cebra adulto para permitir el estudio de la regeneración hepática.
Abstract
La insuficiencia hepática es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, y la mortalidad por enfermedad hepática crónica está aumentando bruscamente en los Estados Unidos. Los hígados sanos son capaces de regenerarse a partir de daños tóxicos, pero en la enfermedad hepática avanzada, la capacidad natural del hígado para regenerarse se ve afectada. El pez cebra ha surgido como un poderoso sistema experimental para estudiar la regeneración. Son un modelo ideal para estudiar la regeneración hepática a partir de la hepatectomía parcial, un procedimiento con relevancia clínica directa en el que se extirpa quirúrgicamente parte del hígado, dejando el resto intacto. No existe un protocolo estándar para la hepatectomía parcial; los estudios anteriores que utilizaron este modelo han utilizado protocolos ligeramente diferentes y han reportado resultados dispares. Aquí se describe un protocolo eficiente y reproducible para realizar una hepatectomía parcial en peces cebra adultos. Utilizamos esta técnica para demostrar que los peces cebra son capaces de regeneración epimórfica del lóbulo resecado. Este protocolo se puede utilizar para interrogar más lejos los mecanismos requeridos para la regeneración del hígado en el pez cebra.
Introduction
Entre los órganos sólidos en los seres humanos, el hígado es el único órgano capaz de regeneración1. Esto es crítico, ya que el hígado es un órgano esencial, responsable de las funciones metabólicas clave, el almacenamiento de energía, la desintoxicación de la sangre, la secreción de proteínas plasmáticas y la producciónde bilis 2. Los hepatocitos perdidos debido a daños tóxicos o inflamatorios se reemplazan principalmente a través de la división de los hepatocitos restantes1. Un modelo experimental clásico para estudiar la regeneración hepática es la hepatectomía parcial, donde se extirpan los lóbulos individuales del hígado, dejando intactos los lóbulos restantes3. Este procedimiento se desarrolló inicialmente en ratas, en las que se eliminan aproximadamente dos tercios de la masa hepática. Después de la hepatectomía parcial en mamíferos, la regeneración compensatoria se produce en los lóbulos restantes hasta que el hígado recupera su masa inicial. En particular, el hígado de los mamíferos no reemplaza los lóbulos que faltan.
El pez cebra(Danio rerio)representa un modelo manejable para el estudio de la regeneración de órganos adultos4. El hígado del pez cebra, aunque estructuralmente diferente del hígado de los mamíferos, está formado por los mismos tipos de células y cumple la misma función que en los mamíferos2. Se compone de tres lóbulos, con dos lóbulos dorsales y un solo lóbulo ventral que se aplanan a lo largo del intestino. Hepatectomy parcial se ha realizado previamente en el pez cebra, con cuentas contradictorias en cuanto al modo exacto de regeneración. Por lo general, una hepatectomía parcial de un tercio se realiza mediante la extirpación de todo el lóbulo ventral. Los informes iniciales indicaron que después de la eliminación del lóbulo ventral, se regeneró completamente dentro de una semana5,6,7,lo que sugiere que en contraste con el hígado de mamífero, el hígado de pez cebra es capaz de regeneración epimórfica. Estudios posteriores demostraron que la eliminación del lóbulo ventral dio lugar a la regeneración compensatoria en los lóbulos dorsales, en lugar de la regeneración del lóbulo ventral faltante, y en última instancia la recuperación de la masa hepática en el plazo de una semana8,9. El perfil transcriptómico de los lóbulos dorsales después de la resección del lóbulo ventral reveló cambios significativos asociados a la regeneración compensatoria10. Dado que el modo de regeneración hepática puede variar con la extensión de la lesión8,especulamos que las discrepancias en los resultados pueden deberse a la variación técnica en el protocolo de hepatectomía parcial entre los grupos de investigación.
Este protocolo describe un procedimiento para realizar un tercio de hepatectomía parcial en el pez cebra adulto mediante la eliminación del lóbulo ventral. Esta técnica será valiosa para evaluar los mecanismos de regeneración hepática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las diferencias anatómicas entre el pez cebra y los modelos de mamíferos para la regeneración hepática presentan desafíos únicos para la resección hepática. El hígado en el pez cebra está muy cerca del corazón y el intestino; inadvertidamente dañando cualquier órgano da lugar a mortalidad creciente. El hígado del pez cebra no está encapsulado, por lo que es más difícil separarse del intestino. El hígado recibe sangre rica en nutrientes del intestino a través de las venas porta. En los mamíferos, las v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I.M.O. es compatible con el NIAAA (F32AA027135). W.G. cuenta con el apoyo de R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 y el Programa Claudia Adams Barr para la Excelencia en la Investigación del Cáncer. W.G. es un Pew Scholar en Ciencias Biomédicas.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
- Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).
