פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא
Summary
מתואר כאן פרוטוקול מיצוי DNA באמצעות חרוזים מגנטיים כדי לייצר עקירות DNA באיכות גבוהה יתושים. עקירות אלה מתאימות לגישת רצף של הדור הבא במורד הזרם.
Abstract
פרוטוקול מיצוי DNA שפורסם לאחרונה באמצעות חרוזים מגנטיים ומכשיר מיצוי DNA אוטומטי הציע כי ניתן לחלץ DNA באיכות גבוהה וכמות מיתוש בודד שמור היטב מספיק עבור ריצוף גנום שלם במורד הזרם. עם זאת, הסתמכות על מכשיר מיצוי DNA אוטומטי יקר יכולה להיות אסורה עבור מעבדות רבות. כאן, המחקר מספק פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוז מגנטי ידידותי לתקציב, אשר מתאים לתפוקה נמוכה עד בינונית. הפרוטוקול המתואר כאן נבדק בהצלחה באמצעות דגימות יתושים Aedes aegypti בודדים. העלויות המופחתות הקשורות להפקת דנ”א באיכות גבוהה יגדילו את היישום של רצף תפוקה גבוהה למעבדות ומחקרים מוגבלים במשאבים.
Introduction
פיתוח לאחרונה של פרוטוקול מיצוי DNA משופר1 אפשר מחקרים רבים בעלי השפעה גבוהה במורד הזרם מעורבים רצף גנום שלם2,3,4,5,6. פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוז מגנטי זה מספק תפוקת DNA אמינה מדגימות יתושים בודדות, אשר בתורו מפחית את העלות ואת הזמן הקשורים לרכישת מספר מספיק של דגימות מאוספי שדה.
ההתקדמות האחרונה בגנומיקה של אוכלוסיה ונוף מתואמת ישירות עם הפחתת עלויות של ריצוף גנום שלם. למרות פרוטוקול חילוץ ה- DNA הקודם1 מגביר את היעילות הקשורה לרצף תפוקה גבוהה, מעבדות / מחקרים קטנים יותר ללא הכספים עשויים לבטל את השימוש בכלי הנוף החדשים והחזקים האלה וגנומיקה באוכלוסייה בשל עלויות יישום הפרוטוקול (למשל, עלויות של מכשירים מיוחדים).
כאן, פרוטוקול מיצוי DNA שונה מוצג המשתמש בצעד מיצוי חרוז מגנטי דומה כמו נימן ואח‘1 כדי להשיג DNA טוהר גבוה אבל לא מסתמך על מכשירים בעלות גבוהה עבור תמיסת רקמות ומיצוי DNA. פרוטוקול זה מתאים לניסויים הדורשים >10 ננוגרם של DNA באיכות גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם למינים אחרים של חרקים. הגרסה המקורית של הפרוטוקול שהוצגה בניימן ואח‘1 נבדקה על מינים מרובים, כולל Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysome…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתמיכה במימון מרכז המצוינות האזורי דרום מערב האוקיינוס השקט למחלות המועברות בווקטורים הממומן על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה”ב (הסכם שיתוף פעולה 1U01CK000516), מענק ה- CDC NU50CK0000420-04-04, המכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות של USDA (פרויקט הצוהר 1025565), מלגת המעבדה לאנטומולוגיה רפואית UF / IFAS פלורידה לטס-יו צ’ן, NSF CAMTech IUCRC שלב II מענק (AWD05009_MOD0030) ופלורידה מחלקת הבריאות (חוזה CODQJ). הממצאים והמסקנות במאמר זה הם אלה של המחברים ואינם מייצגים בהכרח את השקפותיו של שירות הדגים וחיות הבר של ארה”ב.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
