μTongue: منصة التصوير الوظيفي القائمة على Microfluidics لللسان في فيفو
Summary
المادة يقدم μTongue (microfluidics على اللسان) جهاز للتصوير الوظيفي خلية الذوق في الجسم الحي عن طريق دمج microfluidics في نافذة التصوير داخلفيتال على اللسان.
Abstract
المجهر الفلوري داخل الحتمية هو أداة تستخدم على نطاق واسع لدراسة الديناميات متعددة الخلايا في حي. ومع ذلك، فإنه لم يستخدم بنجاح في الجهاز الحسي الذوق. من خلال دمج microfluidics في إطار تصوير اللسان داخل الجسم ، يوفر μTongue صورا وظيفية موثوقة لخلايا الذوق في الجسم الحي تحت التعرض الخاضع للرقابة لأجهزة التثانت المتعددة. في هذه الورقة، يتم تقديم إجراء مفصل خطوة بخطوة لاستخدام نظام μTongue. هناك خمسة الأقسام الفرعية : إعداد حلول التسانت ، وإنشاء وحدة microfluidic ، تركيب العينة ، والحصول على بيانات الصورة الوظيفية ، وتحليل البيانات. كما يتم تقديم بعض النصائح والتقنيات لحل القضايا العملية التي قد تنشأ عند استخدام μTongue.
Introduction
يستخدم المجهر الفلوري داخل الجسم على نطاق واسع لدراسة الديناميكيات الصدغية على الأنسجة الحية. الباحثون بسرعة تطوير أجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا التي توفر تحولات محددة وحساسة من العمليات البيولوجية إلى إشارات مضان – والتي يمكن تسجيلها بسهولة باستخدام المجاهر الفلورية التي تتوفر على نطاق واسع1،2. على الرغم من أن معظم الأعضاء الداخلية في القوارض قد تم التحقيق باستخدام المجهر ، إلا أن تطبيقه الناجح على اللسان لم ينجح بعد3.
أجريت الدراسات السابقة على تصوير الكالسيوم من خلايا الذوق السابق فيفو عن طريق رقيقة المقطع أنسجة اللسان للحصول علىبراعمالذوق circumvallate 4،5،6 أو عن طريق تقشير قبالة ظهارة الذوق للحصول على براعم الذوقالفطرية 7،8. كان إعداد هذه العينات غازيا حتما ، وبالتالي كانت البيئات الدقيقة الطبيعية مثل تدين الأعصاب ، وحواجز نفاذية ، والدورة الدموية ، مضطربة إلى حد كبير. تم الإبلاغ عن أول نافذة تصوير لسان داخل الجسم في عام 2015 من قبل Choi وآخرون ، ولكن التسجيل الوظيفي الموثوق به لم يكن قابلا للتحقيق بسبب الحركة والتحف البصرية الناجمة عن المحفزات السائلة9.
في الآونة الأخيرة ، تم تقديم microfluidics على اللسان (μTongue)10. يدمج هذا الجهاز نظام microfluidic مع نافذة التصوير على لسان الماوس. من خلال تحقيق تدفق شبه ثابت للدولة من المحفزات التسفانت طوال فترة التصوير ، يمكن تقليل القطع الأثرية من الحركة السائلة(الشكل 1). يتم تغذية منفذ الإدخال بواسطة سلسلة من وحدات تحكم الضغط متعددة القنوات ، في حين يتم توصيل منفذ الإخراج بمضخة حقنة ، والتي تحافظ على 0.3 مل / دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقليل القطع الأثرية البصرية الناجمة عن الفرق في المؤشرات الانكسارية لحلول التستان من خلال التحليل النسبي الذي أدخل مؤشرا غير حساس للكالسيوم (tdTomato) بالإضافة إلى مؤشر الكالسيوم (GCaMP6)11. وفر هذا التصميم الاستقرار المجهري لخلايا الذوق في الجسم الحي حتى مع التبديل المفاجئ بين القنوات السائلة. وبالتالي ، فإن μTongue تنفيذ فحص وظيفي موثوق بها من التيستات متعددة لبراعم طعم الماوس في الجسم الحي.
في هذا البروتوكول ، يتم شرح الإجراءات التجريبية بالتفصيل لتصوير الكالسيوم لبراعم الذوق الفطرية الماوس في الجسم الحي باستخدام μTongue. أولا ، يتم وصف إعداد اللعاب الاصطناعي وحلول التسات. ثانيا، يتم إدخال إنشاء نظام microfluidic لتحقيق تدفق شبه ثابت للدولة. ثالثا، يتم تحديد الإجراءات المستخدمة لتركيب لسان الماوس على μTongue للسماح بالحصول على الصورة. وأخيرا، يتم تحديد كل خطوة لتحليل الصور، بما في ذلك تصحيح القطع الأثرية للحركة الجانبية وقياس النسب. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع أي مختبر أبحاث مزود بمرفق فأر ومجهر فوتونين أو معدات مكافئة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصف هنا هو بروتوكول مفصل لتطبيق μTongue للتحقيق في الأنشطة الوظيفية للخلايا الذوق في الجسم الحي. في هذا البروتوكول، يتم إجراء التصوير الوظيفي على خلايا الذوق باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا. بالإضافة إلى استخدام الفئران المعدلة وراثيا، يمكن تحميل الكهربائية من الأصباغ الكال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل معهد العلوم الأساسية (IBS-R015-D1)، وهي منحة المؤسسة الوطنية لبحوث كوريا (NRF) التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT) (رقم 1). 2019M3A9E2061789)، ومنحة المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) (رقم 2019M3E5D2A01058329). ونحن ممتنون لأنسو كيم ويوجين لي على مساعدتهما التقنية.
Materials
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O’Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
