μTongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון ב- Vivo
Summary
המאמר מציג את מכשיר μTongue (microfluidics-on-a-tongue) להדמיית תאי טעם פונקציונליים ב- vivo על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיה תוך-וינטלי על הלשון.
Abstract
מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות תוך-וינטלית היא כלי המשמש באופן נרחב לחקר דינמיקה רב-תאית בחיה חיה. עם זאת, זה לא נעשה שימוש מוצלח באיבר החושי טעם. על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיית הלשון התוך-ויטלי, ה- μTongue מספק תמונות פונקציונליות אמינות של תאי טעם ב- vivo תחת חשיפה מבוקרת לטעמים מרובים. במאמר זה מוצג הליך מפורט שלב אחר שלב לשימוש במערכת μTongue. קיימות חמש סעיפים: הכנת פתרונות טעימים, הקמת מודול מיקרופלואידי, הרכבה לדוגמה, רכישת נתוני תמונה פונקציונליים וניתוח נתונים. כמה טיפים וטכניקות כדי לפתור את הבעיות המעשיות שעלולות להתעורר בעת שימוש μTongue מוצגים גם.
Introduction
מיקרוסקופ פלואורסצנטיות תוך-וינטלית נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור את הדינמיקה השופעת על רקמות חיות. חוקרים מפתחים במהירות חיישנים מקודדים גנטית המספקים טרנספורמציות ספציפיות ורגישות של התהליכים הביולוגיים לאותות פלואורסצנטיות – אשר ניתן להקליט בקלות באמצעות מיקרוסקופים פלואורסצנטיים הזמינים באופן נרחב1,2. למרות שרוב האיברים הפנימיים במכרסמים נחקרו באמצעות המיקרוסקופ, היישום המוצלח שלה ללשון עדיין לא הצליח3.
מחקרים קודמים על הדמיית סידן של תאי טעם נערכו ex vivo על ידי חתך דק של רקמת לשון כדי לקבל בלוטות טעם להקיף4,5,6 או על ידי קילוף אפיתל הטעם כדי להשיגבלוטות טעםפטרייתיות7,8. הכנת דגימות אלה הייתה פולשנית באופן בלתי נמנע, ולכן המיקרו-סביבה הטבעית כגון פנימיות העצבים, מחסומי החן וזרימת הדם, היו מוטרדות במידה רבה. חלון הדמיית הלשון התוך-ויטלי הראשון דווח בשנת 2015 על ידי Choi et al., אך הקלטה פונקציונלית אמינה לא הייתה ברת השגה בגלל התנועה וממצאים אופטיים הנגרמים על ידי גירויים טעימים נוזלים9.
לאחרונה, microfluidics-על-לשון (μTongue) הוצג10. התקן זה משלב מערכת מיקרופלואידית עם חלון הדמיה על לשון העכבר. על-ידי השגת זרימה מעין-יציבה-יציבה של גירויים טעימים לאורך כל תקופת ההדמיה, ניתן היה למזער חפצים מתנועה נוזלית (איור 1). יציאת הקלט ניזונה מסדרה של בקרי לחץ רב-ערוציים, בעוד שיציאת הפלט מחוברת למשאבת מזרק, השומרת על 0.3 מ”ל/דקה. בנוסף, ממצאים אופטיים שנגרמו על ידי ההבדל במדדים שבירה של פתרונות טעימים צומצמו על ידי ניתוח יחסי המציג אינדיקטור סידן חסר רגישות (tdTomato) כמו גם מחוון סידן (GCaMP6)11. עיצוב זה סיפק יציבות מיקרוסקופית של תאי טעם ב- vivo אפילו עם מעבר פתאומי בין ערוצים נוזליים. כתוצאה מכך, μTongue ליישם הקרנה פונקציונלית אמינה של tastants מרובים בלוטות הטעם של העכבר ב vivo.
בפרוטוקול זה, ההליכים הניסיוניים מוסברים בפירוט עבור הדמיית סידן של בלוטות הטעם פטריות העכבר ב vivo באמצעות μTongue. ראשית, הכנת רוק מלאכותי ופתרונות טעימים מתוארת. שנית, הקמת המערכת המיקרופלואידית להשגת זרימת מצב מעין-יציבה מוצגת. שלישית, ההליכים המשמשים להרכבה של לשון העכבר על μTongue כדי לאפשר רכישת תמונה הם מתויגים. לבסוף, כל שלב לניתוח תמונה, כולל תיקון של ממצאי תנועה לרוחב ויחס, מצוין. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לכל מעבדת מחקר עם מתקן עכבר ומיקרוסקופ שני פוטון או ציוד שווה ערך.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתואר כאן פרוטוקול מפורט כדי להחיל μTongue על החקירה של פעילויות פונקציונליות של תאי טעם ב vivo. בפרוטוקול זה, מתבצעת ההדמיה התפקודית על תאי הטעם באמצעות אינדיקטורים לסידן מקודדים גנטית. בנוסף לשימוש בעכברים מהונדסים, טעינה אלקטרופורטית של צבעי סידן (או צבעי חישת מתח) על תאי הטעם יכולה להי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון למדע בסיסי (IBS-R015-D1), מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (מס ‘2019M3A9E2061789), ועל ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) הממומן על ידי ממשלת קוריאה (מס ‘2019M3E5D2A01058329). אנו מודים לאונסו קים ויוג’ין לי על הסיוע הטכני שלהם.
Materials
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O’Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
