JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Temperaturstyret samling og karakterisering af en dråbe interface Bilayer

Published: April 19, 2021
doi:
10.3791/62362
,
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering,University of Tennessee

Summary

Denne protokol beskriver brugen af et feedback temperaturstyret varmesystem til at fremme lipid monolayer samling og dråbe interface bilayer dannelse for lipider med forhøjede smeltetemperaturer, og kapacitance målinger til at karakterisere temperatur-drevet ændringer i membranen.

Abstract

Dråben interface bilayer (DIB) metode til samling af lipid bilayers (dvs. DIBs) mellem lipid-coated vandige dråber i olie giver vigtige fordele versus andre metoder: DIBs er stabile og ofte langvarige, bilayer område kan vendes, folder asymmetri er let kontrolleres via dråbe kompositioner, og væv-lignende netværk af bilayers kan opnås ved at vedlægge mange dråber. Dannelse af DIB’er kræver spontan samling af lipider i lipidmonomer med høj densitet på dråbernes overflader. Mens dette sker let ved stuetemperatur for fælles syntetiske lipider, en tilstrækkelig monolayer eller stabil bilayer undlader at danne på lignende betingelser for lipider med smeltepunkter over stuetemperatur, herunder nogle cellulære lipid ekstrakter. Denne adfærd har sandsynligvis begrænset sammensætningen – og måske den biologiske relevans – af DIB’er i modelmembranundersøgelser. For at løse dette problem præsenteres en eksperimentel protokol for omhyggeligt at opvarme oliereservoiret, der er vært for DIB-dråber og karakterisere virkningerne af temperatur på lipidmembranen. Specifikt viser denne protokol, hvordan man bruger en termisk ledende aluminiumsarmarmatur og resistive varmeelementer, der styres af en feedbacksløjfe til at ordinere forhøjede temperaturer, hvilket forbedrer monolayermontering og bilayerdannelse for et bredere sæt lipidtyper. Membranens strukturelle egenskaber samt lipidernes termotropiske faseovergange, der omfatter bilayeren, kvantificeres ved at måle ændringerne i DIB’s elektriske kapacitance. Sammen kan denne procedure hjælpe med at evaluere biofysiske fænomener i modelmembraner over forskellige temperaturer, herunder bestemmelse af en effektiv smeltetemperatur (TM) for multikomponent lipidblandinger. Denne evne vil således give mulighed for tættere replikation af naturlige faseovergange i modelmembraner og tilskynde til dannelse og brug af modelmembraner fra et bredere skår af membranbestanddele, herunder dem, der bedre fanger heterogeniteten af deres cellulære modstykker.

Introduction

Cellulære membraner er selektivt gennemtrængelige barrierer bestående af tusindvis af lipid typer1, proteiner, kulhydrater og steroler, der indkapsler og underinddeler alle levende celler. At forstå, hvordan deres kompositioner påvirker deres funktioner og afslører, hvordan naturlige og syntetiske molekyler interagerer med, overholder, forstyrrer og translokerer cellulære membraner, er derfor vigtige forskningsområder med vidtrækkende konsekvenser inden for biologi, medicin, kemi, fysik og materialeteknik.

Disse mål for opdagelse direkte drage fordel af gennemprøvede teknikker til at samle, manipulere og studere model membraner, herunder lipid bilayers samlet fra syntetiske eller naturligt forekommende lipider-at efterligne sammensætning, struktur og transport egenskaber af deres cellulære kolleger. I de senere år har dråbe interface bilayer (DIB) metode2,3,4 til opførelse af en planar lipid bilayer mellem lipid-belagt vanddråber i olie fået betydelig opmærksomhed5,6 ,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, og har vist praktiske fordele i forhold til andre tilgange til modelmembrandannelse: DIB-metoden er enkel at udføre, kræver ingen avanceret fabrikation eller forberedelse (f.eks. “maleri”) af et substrat til at støtte membranen, giver konsekvent membraner med overlegen levetid, giver mulighed for standard elektrofysiologi målinger, og forenkler dannelsen af modelmembraner med asymmetriske folder sammensætninger3. Fordi bilayer former spontant mellem dråber og hver dråbe kan skræddersys i position og makeup, DIB-teknikken har også tiltrukket sig stor interesse for at udvikle celleinspirerede materialesystemer, der bygger på brugen af stimuli-responsive membraner18,24,25,26,27,28,29, afbalanceret opdeling og transport14,30,31og vævslignende materialer17,23,32,33,34,35,36.

Størstedelen af de offentliggjorte forsøg med modelmembraner, herunder forsøg med DMB’er, er blevet udført ved stuetemperatur (RT, ~20-25 °C) og med en håndfuld syntetiske lipider (f.eks. DOPC, DPhPC osv.). Denne praksis begrænser omfanget af biofysiske spørgsmål, der kan studeres i modelmembraner, og baseret på observation kan den også begrænse de typer lipider, der kan bruges til at samle DIB’er. For eksempel samler en syntetisk lipid som DPPC, som har en smeltetemperatur på 42 °C, ikke tætpakkede monolag eller danner DIB’er ved RT37. DIB-dannelse ved stuetemperatur har også vist sig vanskelig for naturlige ekstrakter, såsom ekstrakter fra pattedyr (f.eks. hjernens samlede lipidekstrakt, BTLE)38 eller bakterier (f.eks. Escherichia coli total lipidekstrakt, ETLE)37, som indeholder mange forskellige typer lipider og stammer fra celler, der bor ved forhøjede temperaturer (37 °C). Aktivering af undersøgelse af forskellige sammensætninger giver således mulighed for at forstå membranmedierede processer under biologisk relevante forhold.

At hæve oliens temperatur kan tjene to formål: det øger monolayersamlingens kinetik, og det kan forårsage lipider at gennemgå en smeltende overgang for at nå en flydende uorganiseret fase. Begge konsekvenser støtte i monolayer samling39, en forudsætning for en DIB. Ud over opvarmning til bilayerdannelse kan afkøling af membranen efter dannelsen bruges til at identificere termotropiske overgange i enkelt lipid bilayers38, herunder dem i naturlige lipidblandinger (f.eks. BTLE), der kan være vanskelige at opdage ved hjælp af kalorimetri. Ud over at vurdere termotropiske overgange af lipider kan der anvendes præcist varierende DIB-temperatur til at studere temperaturinducerede ændringer i membranstrukturen38 og undersøge, hvordan lipidsammensætning og fluiditet påvirker kinetik hos membranaktive arter (f.eks. poredanne peptider og transmembranproteiner37), herunder pattedyrs- og bakteriemodelmembraner ved en fysiologisk relevant temperatur (37 °C).

Heri vil en beskrivelse af, hvordan man samler et modificeret DIB-oliereservoir og driver en feedback-temperaturregulator for at muliggøre monolayermontering og bilayerdannelse ved temperaturer højere end RT, forklares. Adskilt fra en tidligere protokol40er der medtaget eksplicitte detaljer om integration af instrumentering, der er nødvendig for måling og styring af temperatur parallelt med montering og karakterisering af DIB i oliereservoiret. Proceduren vil således gøre det muligt for en bruger at anvende denne metode til at danne og studere DIB’er på tværs af en række temperaturer i forskellige videnskabelige sammenhænge. Desuden giver de repræsentative resultater specifikke eksempler på de typer målbare ændringer i både membranstruktur og iontransport, der kan forekomme, efterhånden som temperaturen varieres. Disse teknikker er vigtige tilføjelser til de mange biofysiske undersøgelser, der kan designes og udføres effektivt i DIB’er, herunder undersøgelse af kinetik af membranaktive arter i forskellige membransammensætninger.

Protocol

1. Opvarmet armatur forberedelse Der samles 2 stykker 1 mm tykt isolerende gummi trimmet til henholdsvis 25 mm x 40 mm i bredde og længde, 2 stykker af et 6 mm tykt gummi, der også er 25 mm x 40 mm, en forberedt aluminiumsbasearmarmatursamling og et akryloliereservoir, der passer ind i visningsvinduet i aluminiumsbasisarmaturet (se figur S1, S2 og S3 for detaljer om fabrikation og et eksploderet syn på samling). Forbered aluminium armatur først ved at fastgøre til bunden af armaturet et gl…

Representative Results

Figur 1 viser, hvordan aluminiumsarmaturet og akryloliebeholderen fremstilles på mikroskopstadiet til DIB-dannelse. Montering trin 1.2-1.4 tjener til termisk at isolere armaturet fra scenen for mere effektiv opvarmning. Trin 1.5-1.7 viser, hvordan termoelementet fastgøres korrekt til armaturet, og placerer oliereservoiret, og trin 1.8 -1.9 viser anbefalede steder til udlevering af olie i disse stykker. Figur 2 skitserer de komponent…

Discussion

Den protokol, der er beskrevet heri, indeholder instruktioner til montering og drift af et eksperimentelt system til styring af temperaturen på den olie og de dråber, der bruges til at danne DIB’er. Det er især gavnligt at muliggøre DIB-dannelse ved hjælp af lipider, der har smeltetemperaturer over RT. Desuden kan bilayertemperaturen manipuleres ved præcist at variere temperaturen i oliereservoiret for at studere virkningerne af forhøjede temperaturer på forskellige membranegenskaber og egenskaber, herunder kapac…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Den finansielle støtte blev ydet af National Science Foundation Grant CBET-1752197 og Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213.

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Droplet Interface BilayerDIBTemperature-controlled AssemblyCharacterizationMembraneHeat TransferThermocoupleAluminum FixtureAcrylic ReservoirHexadecane OilInsulative RubberResistive Heating ElementsElectrical/optical CharacterizationTemperature-related EffectsCellular EnvironmentsTransport And Signaling PropertiesMembrane ConstituentsNatural Cellular Extracts
check_url/62362?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image