Denne protokol beskriver brugen af et feedback temperaturstyret varmesystem til at fremme lipid monolayer samling og dråbe interface bilayer dannelse for lipider med forhøjede smeltetemperaturer, og kapacitance målinger til at karakterisere temperatur-drevet ændringer i membranen.
Dråben interface bilayer (DIB) metode til samling af lipid bilayers (dvs. DIBs) mellem lipid-coated vandige dråber i olie giver vigtige fordele versus andre metoder: DIBs er stabile og ofte langvarige, bilayer område kan vendes, folder asymmetri er let kontrolleres via dråbe kompositioner, og væv-lignende netværk af bilayers kan opnås ved at vedlægge mange dråber. Dannelse af DIB’er kræver spontan samling af lipider i lipidmonomer med høj densitet på dråbernes overflader. Mens dette sker let ved stuetemperatur for fælles syntetiske lipider, en tilstrækkelig monolayer eller stabil bilayer undlader at danne på lignende betingelser for lipider med smeltepunkter over stuetemperatur, herunder nogle cellulære lipid ekstrakter. Denne adfærd har sandsynligvis begrænset sammensætningen – og måske den biologiske relevans – af DIB’er i modelmembranundersøgelser. For at løse dette problem præsenteres en eksperimentel protokol for omhyggeligt at opvarme oliereservoiret, der er vært for DIB-dråber og karakterisere virkningerne af temperatur på lipidmembranen. Specifikt viser denne protokol, hvordan man bruger en termisk ledende aluminiumsarmarmatur og resistive varmeelementer, der styres af en feedbacksløjfe til at ordinere forhøjede temperaturer, hvilket forbedrer monolayermontering og bilayerdannelse for et bredere sæt lipidtyper. Membranens strukturelle egenskaber samt lipidernes termotropiske faseovergange, der omfatter bilayeren, kvantificeres ved at måle ændringerne i DIB’s elektriske kapacitance. Sammen kan denne procedure hjælpe med at evaluere biofysiske fænomener i modelmembraner over forskellige temperaturer, herunder bestemmelse af en effektiv smeltetemperatur (TM) for multikomponent lipidblandinger. Denne evne vil således give mulighed for tættere replikation af naturlige faseovergange i modelmembraner og tilskynde til dannelse og brug af modelmembraner fra et bredere skår af membranbestanddele, herunder dem, der bedre fanger heterogeniteten af deres cellulære modstykker.
Cellulære membraner er selektivt gennemtrængelige barrierer bestående af tusindvis af lipid typer1, proteiner, kulhydrater og steroler, der indkapsler og underinddeler alle levende celler. At forstå, hvordan deres kompositioner påvirker deres funktioner og afslører, hvordan naturlige og syntetiske molekyler interagerer med, overholder, forstyrrer og translokerer cellulære membraner, er derfor vigtige forskningsområder med vidtrækkende konsekvenser inden for biologi, medicin, kemi, fysik og materialeteknik.
Disse mål for opdagelse direkte drage fordel af gennemprøvede teknikker til at samle, manipulere og studere model membraner, herunder lipid bilayers samlet fra syntetiske eller naturligt forekommende lipider-at efterligne sammensætning, struktur og transport egenskaber af deres cellulære kolleger. I de senere år har dråbe interface bilayer (DIB) metode2,3,4 til opførelse af en planar lipid bilayer mellem lipid-belagt vanddråber i olie fået betydelig opmærksomhed5,6 ,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, og har vist praktiske fordele i forhold til andre tilgange til modelmembrandannelse: DIB-metoden er enkel at udføre, kræver ingen avanceret fabrikation eller forberedelse (f.eks. “maleri”) af et substrat til at støtte membranen, giver konsekvent membraner med overlegen levetid, giver mulighed for standard elektrofysiologi målinger, og forenkler dannelsen af modelmembraner med asymmetriske folder sammensætninger3. Fordi bilayer former spontant mellem dråber og hver dråbe kan skræddersys i position og makeup, DIB-teknikken har også tiltrukket sig stor interesse for at udvikle celleinspirerede materialesystemer, der bygger på brugen af stimuli-responsive membraner18,24,25,26,27,28,29, afbalanceret opdeling og transport14,30,31og vævslignende materialer17,23,32,33,34,35,36.
Størstedelen af de offentliggjorte forsøg med modelmembraner, herunder forsøg med DMB’er, er blevet udført ved stuetemperatur (RT, ~20-25 °C) og med en håndfuld syntetiske lipider (f.eks. DOPC, DPhPC osv.). Denne praksis begrænser omfanget af biofysiske spørgsmål, der kan studeres i modelmembraner, og baseret på observation kan den også begrænse de typer lipider, der kan bruges til at samle DIB’er. For eksempel samler en syntetisk lipid som DPPC, som har en smeltetemperatur på 42 °C, ikke tætpakkede monolag eller danner DIB’er ved RT37. DIB-dannelse ved stuetemperatur har også vist sig vanskelig for naturlige ekstrakter, såsom ekstrakter fra pattedyr (f.eks. hjernens samlede lipidekstrakt, BTLE)38 eller bakterier (f.eks. Escherichia coli total lipidekstrakt, ETLE)37, som indeholder mange forskellige typer lipider og stammer fra celler, der bor ved forhøjede temperaturer (37 °C). Aktivering af undersøgelse af forskellige sammensætninger giver således mulighed for at forstå membranmedierede processer under biologisk relevante forhold.
At hæve oliens temperatur kan tjene to formål: det øger monolayersamlingens kinetik, og det kan forårsage lipider at gennemgå en smeltende overgang for at nå en flydende uorganiseret fase. Begge konsekvenser støtte i monolayer samling39, en forudsætning for en DIB. Ud over opvarmning til bilayerdannelse kan afkøling af membranen efter dannelsen bruges til at identificere termotropiske overgange i enkelt lipid bilayers38, herunder dem i naturlige lipidblandinger (f.eks. BTLE), der kan være vanskelige at opdage ved hjælp af kalorimetri. Ud over at vurdere termotropiske overgange af lipider kan der anvendes præcist varierende DIB-temperatur til at studere temperaturinducerede ændringer i membranstrukturen38 og undersøge, hvordan lipidsammensætning og fluiditet påvirker kinetik hos membranaktive arter (f.eks. poredanne peptider og transmembranproteiner37), herunder pattedyrs- og bakteriemodelmembraner ved en fysiologisk relevant temperatur (37 °C).
Heri vil en beskrivelse af, hvordan man samler et modificeret DIB-oliereservoir og driver en feedback-temperaturregulator for at muliggøre monolayermontering og bilayerdannelse ved temperaturer højere end RT, forklares. Adskilt fra en tidligere protokol40er der medtaget eksplicitte detaljer om integration af instrumentering, der er nødvendig for måling og styring af temperatur parallelt med montering og karakterisering af DIB i oliereservoiret. Proceduren vil således gøre det muligt for en bruger at anvende denne metode til at danne og studere DIB’er på tværs af en række temperaturer i forskellige videnskabelige sammenhænge. Desuden giver de repræsentative resultater specifikke eksempler på de typer målbare ændringer i både membranstruktur og iontransport, der kan forekomme, efterhånden som temperaturen varieres. Disse teknikker er vigtige tilføjelser til de mange biofysiske undersøgelser, der kan designes og udføres effektivt i DIB’er, herunder undersøgelse af kinetik af membranaktive arter i forskellige membransammensætninger.
Den protokol, der er beskrevet heri, indeholder instruktioner til montering og drift af et eksperimentelt system til styring af temperaturen på den olie og de dråber, der bruges til at danne DIB’er. Det er især gavnligt at muliggøre DIB-dannelse ved hjælp af lipider, der har smeltetemperaturer over RT. Desuden kan bilayertemperaturen manipuleres ved præcist at variere temperaturen i oliereservoiret for at studere virkningerne af forhøjede temperaturer på forskellige membranegenskaber og egenskaber, herunder kapac…
The authors have nothing to disclose.
Den finansielle støtte blev ydet af National Science Foundation Grant CBET-1752197 og Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213.
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) | Any | Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope | |
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) | Any | Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements. | |
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid | Sigma Aldrich | M3183 | Buffering agent for lipid solution |
Acrylic substrate | Fabricated in house | HTD_STG_2 | ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation |
Aluminum fixture | Fabricated in house | HTD_STG_1 | Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements |
Brain Total Lipid Extract | Avanti | 131101C-100mg | 25 mg/mL porcine lipid extract |
Compact DAQ Chassis (cDAQ) | National Instruments | cDAQ-9174 | Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules |
Data Acquisition System (DAQ) | Molecular Devices | Digidata 1440A | High resolution analog to digital converter |
Fixed gain amplifier/power supply | Hewlitt Packard | HP 6826A | Amplifies DC voltage output from the voltage output module |
Glass Cover Slip | Corning | CLS284525 | Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer |
Heating element (x2) | Omega | KHLV-101/5 | 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. |
M3 Stainless Steel Screw | McMaster Carr | 90116A150 | Secures thermocouple to aluminum fixture |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | AxoPatch 200B | Measures current and outputs voltage to the headstage |
Personal computer | Any | Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | Electrolyte solution of dissociated ions |
Temperature input module | National Instruments | NI 9211 | Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis |
Thermocouple | Omega | JMTSS-020U-6 | U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length |
UV Curable Adhesive | Loctite | 19739 | Secures glass coverslip to aluminum base fixture |
Voltage output module | National Instruments | NI 9263 | Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis |
Waveform generator | Agilent | 33210A | Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform |