온도 제어 어셈블리 및 방울 인터페이스 Bilayer의 특성화
Summary
이 프로토콜은 높은 용융 온도와 지질에 대한 지질 단층 조립 및 방울 인터페이스 이중 층 형성을 촉진하기 위해 피드백 온도 제어 가열 시스템의 사용을 자세히 설명, 멤브레인의 온도 중심변화를 특성화하는 커패시턴스 측정.
Abstract
지질 코팅 수성 물방울 사이에 지질 이중층(즉, DIBs)을 조립하는 물방울 인터페이스 바이레이어(DIB) 방법은 다른 방법에 비해 주요 이점을 제공합니다: DIB는 안정적이고 종종 오래 지속되며, 이중층 영역은 가역적으로 튜닝될 수 있으며, 리플렛 비대칭은 방울 조성물을 통해 용이하게 조절되고, 양층과 같은 많은 양층 네트워크와 같은 양층 렌즈에 의해 용이하게 제어된다. DIB를 형성하려면 물방울 표면의 고밀도 지질 단층으로 지질의 자발적인 조립이 필요합니다. 이것은 일반적인 합성 지질을 위한 실온에서 쉽게 생기는 동안, 충분한 단층 또는 안정한 이중층은 몇몇 세포 지질 추출물을 포함하여 실온 위의 융점을 가진 지질을 위한 유사한 조건에서 형성하는 것을 실패합니다. 이 행동은 모형 막 연구 결과에서 DIBs의 조성 및 아마 생물학 관련성 -를 제한했습니다. 이 문제를 해결하기 위해 DIB 방울을 호스팅하는 오일 저장소를 조심스럽게 가열하고 지질 막에 온도가 미치는 영향을 특성화하기 위해 실험 프로토콜이 제공됩니다. 특히, 이 프로토콜은 피드백 루프에 의해 제어되는 열 전도성 알루미늄 기구 및 저항 가열 원소를 사용하여 더 넓은 지질 유형에 대한 단층 조립 및 이중층 형성을 향상시키는 높은 온도를 처방하는 방법을 보여줍니다. 멤브레인의 구조적 특성뿐만 아니라 이중층을 포함하는 지질의 열TROPIC 상 전이는 DIB의 전기 커패시턴스의 변화를 측정하여 정량화된다. 이 절차는 다중 성분 지질 혼합물에 대한 효과적인 용융온도(TM)를결정하는 것을 포함하여 다양한 온도에 걸쳐 모델 멤브레인에서 생물 물리 학적 현상을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기능은 따라서 모형 막에 있는 자연적인 위상 전이의 더 가깝게 복제하고 더 나은 그들의 세포 대조물의 이질성을 포착하는 것을 포함하여 막 성분의 더 넓은 swath에서 모형 막의 형성 그리고 사용을 격려할 것입니다.
Introduction
세포막은 모든 살아있는 세포를 캡슐화하고 세분화하는 수천 가지 지질 유형1,단백질, 탄수화물 및 스테롤로 구성된 선택적으로 투과성 장벽입니다. 그들의 구성이 그들의 기능에 어떻게 영향을 미치는지 이해하고 자연 및 합성 분자가 세포막과 상호 작용, 준수, 중단 및 배할당하는 방법을 밝히는 방법, 따라서 생물학, 의학, 화학, 물리학 및 재료 공학에 광범위한 영향을 미치는 연구의 중요한 영역입니다.
이러한 발견을 목표로 하는 목적은 세포 측의 구성, 구조 및 운송 특성을 모방한 합성 또는 자연발생 지질에서 조립된 지질 이중층을 포함하여 모델 멤브레인을 조립, 조작 및 연구하기 위한 입증된 기술의 직접적인 이점을 누릴 수 있습니다. 최근에는, 액적 인터페이스 바이레이어(DIB) 방법2,3,4는 지질 코팅물 양적물 사이의 평면 지질 이중층을 생성하기 위한것으로, 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,모델 멤브레인 형성을 위한 다른 접근법에 비해 실질적인 이점을 입증하였다: DIB 방법은 수행하기 가 간단하다. 정교한 제작이나 준비가 필요하지 않습니다(예: 멤브레인을 지원하는 기판의 “페인팅”) 지속적으로 우수한 멤브레인을 산출 수명은 표준 전기 생리학 측정을 허용하며 비대칭 전단지조성물 3로모델 멤브레인의 형성을 단순화합니다. 이중 레이어는 물방울과 각 방울 사이에 자발적으로 형성되기 때문에 위치와 메이크업에 맞게 조정할 수 있습니다. DIB 기술은 또한 자극 반응형 멤브레인18,24,25,26,27, 28,29,균형 잡힌 구획화 및 수송14,30,31,및 조직형 재료17,23,32,33, 33,35, 35,35의사용에 기반한 세포에서 영감을 받은 재료 시스템 개발에 상당한 관심을 모으고있다.
DIB를 가진 사람들을 포함하여 모형 막에 간행된 실험의 대다수는, 실온에서 수행되었습니다 (RT, 20-25°C) 및 합성 지질의 소수와 (예를 들면, DOPC, DPhPC 등). 이 사례는 모형 막에서 공부될 수 있는 생물물리학적인 질문의 범위를 제한하고, 관찰에 근거하여, 또한 DIB를 조립하기 위하여 이용될 수 있는 지질의 모형을 제한할 수 있습니다. 예를 들어, 42°C의 용융 온도를 가지는 DPPC와 같은 합성 지질은 RT37에서단단히 포장된 단층층을 조립하거나 DIB를 형성하지 않는다. 실온에서 DIB 형성은 또한 포유류(예를 들어, 뇌 총 지질 추출물, BTLE)38 또는 박테리아(예를 들어, 에체리치아 대장균 총 지질 추출물, ETLE) 37, 높은 온도(37°C)에 상주하는 세포에서 유래하는 천연 추출물(예를 들어, 뇌 총 지질 추출물, BTLE)37과같은 천연 추출물에 대해도 어렵다는 것이 입증되었습니다. 따라서 다양한 조성물의 연구를 가능하게 하면 생물학적으로 관련된 조건에서 막 매개 공정을 이해할 수 있는 기회를 제공합니다.
오일의 온도를 올리는 것은 두 가지 목적을 제공 할 수 있습니다 : 그것은 단층 조립의 운동을 증가하고 지질이 액체 무질서한 단계에 도달하기 위해 용융 전환을 겪을 수 있습니다. 두 결과 모두 DIB의 전제 조건인 단층어셈블리(39)에도움이 됩니다. 이중층 형성을 위한 가열 이외에, 형성 후 멤브레인을 냉각시켜 열량계를 사용하여 검출하기 어려울 수 있는 천연 지질 혼합물(예를 들어, BTLE)을 포함하여 단일 지질이중층(38)에서열tropic 전이를 식별하는 데 사용될 수 있다. 지질의 열Tropic 전이를 평가하는 것 외에도, DIB의 온도를 정확하게 변화하여 막구조(38)의 온도 유발 변화를 연구하고 지질 조성 및 유동성이 막 활성 종의 운동(예를 들어, 모공 형성 펩타이드 및 트랜스멤브레인 단백질37)의운동에 어떤 영향을 미치는지 검사할 수 있다.37), 포유동물 및 세균성 모델 멤브레인을 포함하는 포유류 및 세균성 모델 멤브레인(37).
본 명세서에서는, 수정된 DIB 오일 저장소를 조립하고 피드백 온도 컨트롤러를 작동시켜 RT보다 높은 온도에서 단층 조립 및 이중층 형성을 가능하게 하는 방법에 대한 설명이 설명될 것이다. 이전프로토콜(40)과구별되는, 오일 저수지내DIB의 조립 및 특성화에 병행하여 온도를 측정하고 제어하는 데 필요한 계측의 통합에 관한 명시적 세부 사항이 포함되어 있다. 따라서 이 절차를 통해 사용자는 다양한 과학적 맥락에서 다양한 온도에서 DIB를 형성하고 연구하기 위한 이 방법을 적용할 수 있습니다. 더욱이, 대표적인 결과는 온도가 다양함에 따라 발생할 수 있는 멤브레인 구조와 이온 수송 모두에서 측정 가능한 변화의 유형에 대한 구체적인 예를 제공한다. 이러한 기술은 다른 막 조성에서 막 활성 종의 운동학을 연구하는 것을 포함하여 DIBs에서 효과적으로 설계및 수행 될 수있는 많은 생물 물리학 연구에 중요한 추가입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 명세서에 기재된 프로토콜은 DIB를 형성하는 데 사용되는 오일 및 물방울의 온도를 제어하기 위해 실험 시스템을 조립하고 운영하기 위한 지침을 제공한다. 특히 RT 이상의 온도가 녹는 지질을 사용하여 DIB 형성을 가능하게 하는 데 특히 유용합니다. 더욱이, 오일 저수지의 온도를 정밀하게 변화시킴으로써, 이중층 온도는 커패시턴스, 면적, 두께, 유도된 열tropic 상 변화, 막 활성 종의 운동, 및 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
재정 지원은 국립 과학 재단 그랜트 CBET-1752197및 과학 연구 보조금 FA9550-19-1-0213의 공군 사무실에 의해 제공되었다.
Materials
| 25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) | Any | Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope | |
| 25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) | Any | Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements. | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid | Sigma Aldrich | M3183 | Buffering agent for lipid solution |
| Acrylic substrate | Fabricated in house | HTD_STG_2 | ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation |
| Aluminum fixture | Fabricated in house | HTD_STG_1 | Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements |
| Brain Total Lipid Extract | Avanti | 131101C-100mg | 25 mg/mL porcine lipid extract |
| Compact DAQ Chassis (cDAQ) | National Instruments | cDAQ-9174 | Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules |
| Data Acquisition System (DAQ) | Molecular Devices | Digidata 1440A | High resolution analog to digital converter |
| Fixed gain amplifier/power supply | Hewlitt Packard | HP 6826A | Amplifies DC voltage output from the voltage output module |
| Glass Cover Slip | Corning | CLS284525 | Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer |
| Heating element (x2) | Omega | KHLV-101/5 | 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. |
| M3 Stainless Steel Screw | McMaster Carr | 90116A150 | Secures thermocouple to aluminum fixture |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | AxoPatch 200B | Measures current and outputs voltage to the headstage |
| Personal computer | Any | Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | Electrolyte solution of dissociated ions |
| Temperature input module | National Instruments | NI 9211 | Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis |
| Thermocouple | Omega | JMTSS-020U-6 | U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length |
| UV Curable Adhesive | Loctite | 19739 | Secures glass coverslip to aluminum base fixture |
| Voltage output module | National Instruments | NI 9263 | Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis |
| Waveform generator | Agilent | 33210A | Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform |
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