Denne protokollen beskriver bruken av et feedback temperaturkontrollert varmesystem for å fremme lipid monolayer montering og dråpe grensesnitt bilayer formasjon for lipider med forhøyede smeltetemperaturer, og kapasitansmålinger for å karakterisere temperaturdrevne endringer i membranen.
Dråpegrensesnittet bilayer (DIB) metode for montering av lipid bilayers (dvs. DIBs) mellom lipidbelagte vandige dråper i olje gir viktige fordeler i forhold til andre metoder: DIBer er stabile og ofte langvarige, bilayerområdet kan justeres reversibelt, brosjyreasymmetri kontrolleres lett via dråpesammensetninger, og vevslignende nettverk av bilayers kan oppnås ved å tilstøte mange dråper. Forming av DIBer krever spontan montering av lipider i lipidmonolayers med høy tetthet på overflatene av dråpene. Selv om dette skjer lett ved romtemperatur for vanlige syntetiske lipider, klarer ikke en tilstrekkelig monolayer eller stabil bilayer å danne seg under lignende forhold for lipider med smeltepunkter over romtemperatur, inkludert noen cellulære lipidekstrakter. Denne atferden har sannsynligvis begrenset sammensetningene – og kanskje den biologiske relevansen – av DIBer i modellmembranstudier. For å løse dette problemet presenteres en eksperimentell protokoll for å forsiktig varme oljereservoaret som er vert for DIB-dråper og karakterisere effekten av temperatur på lipidmembranen. Spesielt viser denne protokollen hvordan du bruker en termisk ledende aluminiumsarmatur og resistive varmeelementer styrt av en tilbakemeldingssløyfe for å foreskrive forhøyede temperaturer, noe som forbedrer monolayermontering og bilayerdannelse for et bredere sett med lipidtyper. Strukturelle egenskaper av membranen, samt de termotrope faseovergangene til lipidene som består av bilayeren, kvantifiseres ved å måle endringene i elektrisk kapasitans av DIB. Sammen kan denne prosedyren bidra til å evaluere biofysiske fenomener i modellmembraner over ulike temperaturer, inkludert å bestemme en effektiv smeltetemperatur (TM) for lipidblandinger med flere komponenter. Denne evnen vil dermed muliggjøre nærmere replikering av naturlige faseoverganger i modellmembraner og oppmuntre til dannelse og bruk av modellmembraner fra en bredere svor av membranbestanddeler, inkludert de som bedre fanger heterogeniteten til sine cellulære kolleger.
Cellulære membraner er selektivt gjennomtrengelige barrierer som består av tusenvis av lipidtyper1, proteiner, karbohydrater og steroler som innkapsler og deler opp alle levende celler. Forstå hvordan deres komposisjoner påvirker deres funksjoner og avdekke hvordan naturlige og syntetiske molekyler samhandler med, holder seg til, forstyrrer og omfordeler cellulære membraner, er derfor viktige forskningsområder med vidtrekkende implikasjoner innen biologi, medisin, kjemi, fysikk og materialteknikk.
Disse målene for oppdagelse drar direkte nytte av velprøvde teknikker for montering, manipulering og studier av modellmembraner – inkludert lipid-bilayere samlet fra syntetiske eller naturlig forekommende lipider – som etterligner sammensetningen, strukturen og transportegenskapene til sine cellulære kolleger. I de senere år har dråpegrensesnittet bilayer (DIB) metode2,3,4 for å konstruere en planar lipidbilayer mellom lipidbelagte vanndråper i olje fått betydelig oppmerksomhet5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, og har vist praktiske fordeler i forhold til andre tilnærminger for modellmembrandannelse: DIB-metoden er enkel å utføre, krever ingen sofistikert fabrikasjon eller forberedelse (f.eks. “maleri”) av et substrat for å støtte membranen, gir konsekvent membraner med overlegen levetid, muliggjør standard elektrofysiologimålinger, og forenkler dannelsen av modellmembraner med asymmetriske brosjyresammensetninger3. Fordi bilayer dannes spontant mellom dråper og hver dråpe kan skreddersys i posisjon og sminke, DIB-teknikken har også tiltrukket seg betydelig interesse for å utvikle celleinspirerte materialsystemer som bygger på bruk av stimuli-responsive membraner18,24,25,26,27,28,29, balansert oppdeling og transport14,30,31og vevlignende materialer17,23,32,33,34,35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 ,35.
De fleste publiserte eksperimenter på modellmembraner, inkludert de med DIB, har blitt utført ved romtemperatur (RT, ~ 20-25 °C) og med en håndfull syntetiske lipider (f.eks. DOPC, DPhPC, etc.). Denne praksisen begrenser omfanget av biofysiske spørsmål som kan studeres i modellmembraner, og basert på observasjon kan det også begrense hvilke typer lipider som kan brukes til å montere DIB. For eksempel monterer ikke en syntetisk lipid som DPPC, som har en smeltetemperatur på 42 °C, tettpakkede monolagre eller danner DIBer ved RT37. DIB-dannelse ved romtemperatur har også vist seg vanskelig for naturlige ekstrakter, for eksempel de fra pattedyr (f.eks. hjernetotal lipidekstrakt, BTLE)38 eller bakterier (f.eks. Escherichia coli total lipidekstrakt, ETLE)37, som inneholder mange forskjellige typer lipider og stammer fra celler som ligger ved forhøyede temperaturer (37 °C). Å muliggjøre studier av ulike komposisjoner gir dermed muligheter til å forstå membranmediert prosess under biologisk relevante forhold.
Å øke temperaturen på oljen kan tjene to formål: det øker kinetikken til monolayermontering, og det kan føre til at lipider gjennomgår en smeltende overgang for å nå en væskeforstyrrelsesfase. Begge konsekvensene hjelper i monolayer montering39, en forutsetning for en DIB. I tillegg til oppvarming for bilayerdannelse, kan kjøling av membranen etter formasjonen brukes til å identifisere termotrope overganger i enkle lipidbilayers38, inkludert de i naturlige lipidblandinger (f.eks. BTLE) som kan være vanskelig å oppdage ved hjelp av kalorimetri. Bortsett fra å vurdere termotrope overganger av lipider, kan nøyaktig varierende temperaturen på DIB brukes til å studere temperaturinduserte endringer imembranstruktur 38 og undersøke hvordan lipidsammensetning og fluiditet påvirker kinetikken til membranaktive arter (f.eks. poredannende peptider og transmembranproteiner37), inkludert pattedyr og bakterielle modellmembraner ved en fysiologisk relevant temperatur (37 °C).
Heri vil en beskrivelse av hvordan man monterer et modifisert DIB-oljereservoar og bruker en feedback-temperaturregulator for å muliggjøre monolayermontering og bilayerdannelse ved temperaturer høyere enn RT forklares. Skiller seg fra en tidligere protokoll40, er eksplisitt detalj inkludert om integrering av instrumentering som trengs for å måle og kontrollere temperaturen parallelt med montering og karakterisering av DIB i oljebeholderen. Prosedyren vil dermed gjøre det mulig for en bruker å anvende denne metoden for å danne og studere DIBer på tvers av en rekke temperaturer i en rekke vitenskapelige sammenhenger. Videre gir de representative resultatene konkrete eksempler på hvilke typer målbare endringer i både membranstruktur og iontransport som kan oppstå etter hvert som temperaturen varierer. Disse teknikkene er viktige tillegg til de mange biofysiske studiene som kan utformes og utføres effektivt i DIBer, inkludert å studere kinetikken til membranaktive arter i forskjellige membransammensetninger.
Protokollen som er beskrevet her, gir instruksjoner for montering og drift av et eksperimentelt system for å kontrollere temperaturen på oljen og dråpene som brukes til å danne DIBer. Det er spesielt gunstig for å muliggjøre DIB-dannelse ved hjelp av lipider som har smeltetemperaturer over RT. Videre, ved nøyaktig å variere temperaturen i oljereservoaret, kan bilayertemperaturen manipuleres for å studere effekten av forhøyede temperaturer på ulike membranegenskaper og egenskaper, inkludert kapasitans, område,…
The authors have nothing to disclose.
Økonomisk støtte ble gitt av National Science Foundation Grant CBET-1752197 og Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213.
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) | Any | Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope | |
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) | Any | Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements. | |
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid | Sigma Aldrich | M3183 | Buffering agent for lipid solution |
Acrylic substrate | Fabricated in house | HTD_STG_2 | ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation |
Aluminum fixture | Fabricated in house | HTD_STG_1 | Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements |
Brain Total Lipid Extract | Avanti | 131101C-100mg | 25 mg/mL porcine lipid extract |
Compact DAQ Chassis (cDAQ) | National Instruments | cDAQ-9174 | Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules |
Data Acquisition System (DAQ) | Molecular Devices | Digidata 1440A | High resolution analog to digital converter |
Fixed gain amplifier/power supply | Hewlitt Packard | HP 6826A | Amplifies DC voltage output from the voltage output module |
Glass Cover Slip | Corning | CLS284525 | Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer |
Heating element (x2) | Omega | KHLV-101/5 | 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. |
M3 Stainless Steel Screw | McMaster Carr | 90116A150 | Secures thermocouple to aluminum fixture |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | AxoPatch 200B | Measures current and outputs voltage to the headstage |
Personal computer | Any | Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | Electrolyte solution of dissociated ions |
Temperature input module | National Instruments | NI 9211 | Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis |
Thermocouple | Omega | JMTSS-020U-6 | U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length |
UV Curable Adhesive | Loctite | 19739 | Secures glass coverslip to aluminum base fixture |
Voltage output module | National Instruments | NI 9263 | Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis |
Waveform generator | Agilent | 33210A | Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform |