Temperaturkontrollert montering og karakterisering av et dråpegrensesnitt Bilayer

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av et feedback temperaturkontrollert varmesystem for å fremme lipid monolayer montering og dråpe grensesnitt bilayer formasjon for lipider med forhøyede smeltetemperaturer, og kapasitansmålinger for å karakterisere temperaturdrevne endringer i membranen.

Abstract

Dråpegrensesnittet bilayer (DIB) metode for montering av lipid bilayers (dvs. DIBs) mellom lipidbelagte vandige dråper i olje gir viktige fordeler i forhold til andre metoder: DIBer er stabile og ofte langvarige, bilayerområdet kan justeres reversibelt, brosjyreasymmetri kontrolleres lett via dråpesammensetninger, og vevslignende nettverk av bilayers kan oppnås ved å tilstøte mange dråper. Forming av DIBer krever spontan montering av lipider i lipidmonolayers med høy tetthet på overflatene av dråpene. Selv om dette skjer lett ved romtemperatur for vanlige syntetiske lipider, klarer ikke en tilstrekkelig monolayer eller stabil bilayer å danne seg under lignende forhold for lipider med smeltepunkter over romtemperatur, inkludert noen cellulære lipidekstrakter. Denne atferden har sannsynligvis begrenset sammensetningene – og kanskje den biologiske relevansen – av DIBer i modellmembranstudier. For å løse dette problemet presenteres en eksperimentell protokoll for å forsiktig varme oljereservoaret som er vert for DIB-dråper og karakterisere effekten av temperatur på lipidmembranen. Spesielt viser denne protokollen hvordan du bruker en termisk ledende aluminiumsarmatur og resistive varmeelementer styrt av en tilbakemeldingssløyfe for å foreskrive forhøyede temperaturer, noe som forbedrer monolayermontering og bilayerdannelse for et bredere sett med lipidtyper. Strukturelle egenskaper av membranen, samt de termotrope faseovergangene til lipidene som består av bilayeren, kvantifiseres ved å måle endringene i elektrisk kapasitans av DIB. Sammen kan denne prosedyren bidra til å evaluere biofysiske fenomener i modellmembraner over ulike temperaturer, inkludert å bestemme en effektiv smeltetemperatur (T_M) for lipidblandinger med flere komponenter. Denne evnen vil dermed muliggjøre nærmere replikering av naturlige faseoverganger i modellmembraner og oppmuntre til dannelse og bruk av modellmembraner fra en bredere svor av membranbestanddeler, inkludert de som bedre fanger heterogeniteten til sine cellulære kolleger.

Introduction

Cellulære membraner er selektivt gjennomtrengelige barrierer som består av tusenvis av lipidtyper¹, proteiner, karbohydrater og steroler som innkapsler og deler opp alle levende celler. Forstå hvordan deres komposisjoner påvirker deres funksjoner og avdekke hvordan naturlige og syntetiske molekyler samhandler med, holder seg til, forstyrrer og omfordeler cellulære membraner, er derfor viktige forskningsområder med vidtrekkende implikasjoner innen biologi, medisin, kjemi, fysikk og materialteknikk.

Disse målene for oppdagelse drar direkte nytte av velprøvde teknikker for montering, manipulering og studier av modellmembraner – inkludert lipid-bilayere samlet fra syntetiske eller naturlig forekommende lipider – som etterligner sammensetningen, strukturen og transportegenskapene til sine cellulære kolleger. I de senere år har dråpegrensesnittet bilayer (DIB) metode^2,3,4 for å konstruere en planar lipidbilayer mellom lipidbelagte vanndråper i olje fått betydelig oppmerksomhet^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}, og har vist praktiske fordeler i forhold til andre tilnærminger for modellmembrandannelse: DIB-metoden er enkel å utføre, krever ingen sofistikert fabrikasjon eller forberedelse (f.eks. “maleri”) av et substrat for å støtte membranen, gir konsekvent membraner med overlegen levetid, muliggjør standard elektrofysiologimålinger, og forenkler dannelsen av modellmembraner med asymmetriske brosjyresammensetninger³. Fordi bilayer dannes spontant mellom dråper og hver dråpe kan skreddersys i posisjon og sminke, DIB-teknikken har også tiltrukket seg betydelig interesse for å utvikle celleinspirerte materialsystemer som bygger på bruk av stimuli-responsive membraner^{18,24,25,26,27,28,29}, balansert oppdeling og transport^14,30,31og vevlignende materialer^{17,23,32,33,34,}35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 ,^35.

De fleste publiserte eksperimenter på modellmembraner, inkludert de med DIB, har blitt utført ved romtemperatur (RT, ~ 20-25 °C) og med en håndfull syntetiske lipider (f.eks. DOPC, DPhPC, etc.). Denne praksisen begrenser omfanget av biofysiske spørsmål som kan studeres i modellmembraner, og basert på observasjon kan det også begrense hvilke typer lipider som kan brukes til å montere DIB. For eksempel monterer ikke en syntetisk lipid som DPPC, som har en smeltetemperatur på 42 °C, tettpakkede monolagre eller danner DIBer ved RT³⁷. DIB-dannelse ved romtemperatur har også vist seg vanskelig for naturlige ekstrakter, for eksempel de fra pattedyr (f.eks. hjernetotal lipidekstrakt, BTLE)³⁸ eller bakterier (f.eks. Escherichia coli total lipidekstrakt, ETLE)³⁷, som inneholder mange forskjellige typer lipider og stammer fra celler som ligger ved forhøyede temperaturer (37 °C). Å muliggjøre studier av ulike komposisjoner gir dermed muligheter til å forstå membranmediert prosess under biologisk relevante forhold.

Å øke temperaturen på oljen kan tjene to formål: det øker kinetikken til monolayermontering, og det kan føre til at lipider gjennomgår en smeltende overgang for å nå en væskeforstyrrelsesfase. Begge konsekvensene hjelper i monolayer montering³⁹, en forutsetning for en DIB. I tillegg til oppvarming for bilayerdannelse, kan kjøling av membranen etter formasjonen brukes til å identifisere termotrope overganger i enkle lipidbilayers³⁸, inkludert de i naturlige lipidblandinger (f.eks. BTLE) som kan være vanskelig å oppdage ved hjelp av kalorimetri. Bortsett fra å vurdere termotrope overganger av lipider, kan nøyaktig varierende temperaturen på DIB brukes til å studere temperaturinduserte endringer i^{membranstruktur 38} og undersøke hvordan lipidsammensetning og fluiditet påvirker kinetikken til membranaktive arter (f.eks. poredannende peptider og transmembranproteiner³⁷), inkludert pattedyr og bakterielle modellmembraner ved en fysiologisk relevant temperatur (37 °C).

Heri vil en beskrivelse av hvordan man monterer et modifisert DIB-oljereservoar og bruker en feedback-temperaturregulator for å muliggjøre monolayermontering og bilayerdannelse ved temperaturer høyere enn RT forklares. Skiller seg fra en tidligere protokoll⁴⁰, er eksplisitt detalj inkludert om integrering av instrumentering som trengs for å måle og kontrollere temperaturen parallelt med montering og karakterisering av DIB i oljebeholderen. Prosedyren vil dermed gjøre det mulig for en bruker å anvende denne metoden for å danne og studere DIBer på tvers av en rekke temperaturer i en rekke vitenskapelige sammenhenger. Videre gir de representative resultatene konkrete eksempler på hvilke typer målbare endringer i både membranstruktur og iontransport som kan oppstå etter hvert som temperaturen varierer. Disse teknikkene er viktige tillegg til de mange biofysiske studiene som kan utformes og utføres effektivt i DIBer, inkludert å studere kinetikken til membranaktive arter i forskjellige membransammensetninger.

Protocol

1. Klargjøring av oppvarmet armatur Samle 2 stykker av 1 mm tykk isolasjonsgummi trimmet til henholdsvis 25 mm x 40 mm i bredde og lengde, 2 deler av en 6 mm tykk gummi som også er 25 mm x 40 mm, en forberedt aluminiumsbasearmaturmontering og et akryloljereservoar som passer i visningsvinduet til aluminiumsbasearmaturen (se figur S1, S2 og S3 for detaljer om fabrikasjon og en eksplodert visning av montering). Forbered aluminiumsarmaturen først ved å feste til bunnen av armaturen et glassdek…

Representative Results

Figur 1 viser hvordan aluminiumsarmaturen og akryloljereservoaret fremstilles på mikroskopstadiet for DIB-dannelse. Monteringstrinn 1.2-1.4 tjener til å isolere armaturen termisk fra scenen for mer effektiv oppvarming. Trinn 1.5-1.7 viser hvordan du fester termoelementet riktig til armaturen og plasserer oljebeholderen, og trinn 1,8 -1,9 viser anbefalte steder for dispensering av olje i disse stykkene. Figur 2 skisserer komponentene…

Discussion

Protokollen som er beskrevet her, gir instruksjoner for montering og drift av et eksperimentelt system for å kontrollere temperaturen på oljen og dråpene som brukes til å danne DIBer. Det er spesielt gunstig for å muliggjøre DIB-dannelse ved hjelp av lipider som har smeltetemperaturer over RT. Videre, ved nøyaktig å variere temperaturen i oljereservoaret, kan bilayertemperaturen manipuleres for å studere effekten av forhøyede temperaturer på ulike membranegenskaper og egenskaper, inkludert kapasitans, område,…

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)	Any		Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)	Any		Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid	Sigma Aldrich	M3183	Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate	Fabricated in house	HTD_STG_2	~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture	Fabricated in house	HTD_STG_1	Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements
Brain Total Lipid Extract	Avanti	131101C-100mg	25 mg/mL porcine lipid extract
Compact DAQ Chassis (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ)	Molecular Devices	Digidata 1440A	High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply	Hewlitt Packard	HP 6826A	Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip	Corning	CLS284525	Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.
M3 Stainless Steel Screw	McMaster Carr	90116A150	Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	AxoPatch 200B	Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer	Any		Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P3911	Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module	National Instruments	NI 9211	Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple	Omega	JMTSS-020U-6	U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive	Loctite	19739	Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module	National Instruments	NI 9263	Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator	Agilent	33210A	Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform