Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Mahmoud A. S. Abdelhamid; Alice V. Rhind-Tutt; Benjamin Ambrose; Timothy D. Craggs

doi:10.3791/62378

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Biochemistry

ओपन-सोर्स smfBox का उपयोग कर सटीक और सटीक एकल-अणु FRET माप बनाना

Published: July 05, 2021

doi:

10.3791/62378

Mahmoud A. S. Abdelhamid*¹, Alice V. Rhind-Tutt*¹, Benjamin Ambrose, Timothy D. Craggs

¹Sheffield Institute for Nucleic Acids, Department of Chemistry,University of Sheffield

Summary

यह आलेख व्यक्तिगत पर पूरी तरह से सही सटीक FRET माप बनाने के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है, स्वतंत्र रूप से खुले स्रोत, सस्ती smfBox का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल्स को अलग करता है, स्विच ऑन से, संरेखण के माध्यम से और ध्यान केंद्रित करने के लिए, डेटा संग्रह और विश्लेषण के लिए।

Abstract

SmfBox एकल-अणु Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) के लिए हाल ही में विकसित लागत प्रभावी, ओपन-सोर्स उपकरण है, जो स्वतंत्र रूप से बायोमोलेक्यूल्स को अधिक सुलभ बनाता है। इस अवलोकन में डुप्लेक्स डीएनए नमूनों में सटीक FRET दक्षताओं के माप करने के लिए इस उपकरण का उपयोग करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल शामिल है, जिसमें नमूना तैयारी, उपकरण सेटअप और संरेखण, डेटा अधिग्रहण और पूर्ण विश्लेषण दिनचर्या का विवरण शामिल है। प्रस्तुत दृष्टिकोण, जिसमें सटीक FRET-व्युत्पन्न दूरी माप के लिए आवश्यक सभी सुधार कारकों को निर्धारित करना शामिल है, FRET समुदाय में हाल के सहयोगी कार्य के एक बड़े शरीर पर बनाता है, जिसका उद्देश्य मानक प्रोटोकॉल और विश्लेषण दृष्टिकोण स्थापित करना है। यह प्रोटोकॉल, जो आसानी से बायोमोलेक्यूलर सिस्टम की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलहै, व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए smFRET को लोकतांत्रिक बनाने में बढ़ते प्रयासों को जोड़ता है।

Introduction

एकल-अणु Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) एक ऐसी तकनीक है जो व्यक्तिगत अणुओं के स्तर पर दो रंगों-एक दाता और एक स्वीकर्ता के बीच FRET दक्षता को मापता है। FRET दो रंगों के अतिव्यापी ऊर्जा स्पेक्ट्रा से उत्पन्न होने वाली एक फोटोफिजिकल प्रक्रिया है: दाता एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के प्रकाश से उत्साहित होता है और स्वीकर्ता को गैर-विकिरणीय रूप से ऊर्जा स्थानांतरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप स्वीकर्ता से उत्सर्जन होता है। इस हस्तांतरण की दक्षता दो रंगों के बीच की दूरी की छठी शक्ति के व्युत्क्रमानुपाती है, इसलिए स्थानांतरण दक्षता दूरी ¹ के साथ भिन्न होती है। इस प्रकार, इस FRET दक्षता का उपयोग अणु (ओं) ² के बारे में स्थानिक जानकारी निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें रंजक जुड़े हुए हैं, 3-10 एनएम की सीमा के भीतर। यह पैमाने पर, और तथ्य यह है कि FRET दक्षता में परिवर्तन Angstrom आणविक आंदोलनों ³ के प्रति संवेदनशील हैं, तकनीक को बायोमोलेक्यूल्स के बारे में संरचनात्मक जानकारी की जांच करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल बनाता है- जैसे न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन-पहनावा औसत की जटिलताओं के बिना ^4,5,6। जबकि सापेक्ष FRET दक्षताओं में परिवर्तन का उपयोग बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन और संरचनात्मक गतिशीलता की निगरानी के लिए किया जा सकता है, प्रोटीन (un) तह, प्रतिलेखन, और डीएनए प्रतिकृति और मरम्मत जैसी प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं पर प्रकाश डाला जा सकता है, पूर्ण FRET दक्षता का उपयोग बायोमोलेक्यूलर संरचना निर्धारण ^के लिए सटीक दूरी निर्धारित करने के लिए किया गया है7,8,9,10,11 , क्रिस्टलीकरण या ठंड की आवश्यकता पर काबू पाने के रूप में कुछ अन्य संरचनात्मक तरीकों के लिए आवश्यक ^है4,12.

smFRET प्रयोगों सबसे अधिक दो रूपों, confocal या कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी ले लो. दोनों दृष्टिकोणों के बीच बायोमोलेक्यूल्स की आणविक गतिशीलता की जांच आमतौर पर पिको से मिलीसेकंड (कॉन्फोकल, स्वतंत्र रूप से अलग अणुओं) से मिलीसेकंड से लेकर घंटों तक (टीआईआरएफ, सतह स्थिर अणुओं) तक टाइमस्केल पर की जा सकती है। यह प्रत्येक तकनीक में शामिल विभिन्न सेटअपों के कारण है। TIRF माइक्रोस्कोपी में, अणुओं को स्लाइड की सतह पर स्थिर किया जाता है और एक तरंग (चित्रा 1 ए) द्वारा उत्तेजित किया जाता है। यहां, हालांकि, फोकस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर है क्योंकि यह smfBox का प्रारूप है। Confocal माइक्रोस्कोपी में, अणुओं को स्थिर नहीं किया जाता है और इसके बजाय स्वतंत्र रूप से confocal मात्रा (~ 1 fL) के माध्यम से ब्राउनियन गति के माध्यम से फैलाया जाता है, जो समाधान के भीतर कुछ निर्दिष्ट गहराई पर एक स्थान पर एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर लेंस के माध्यम से एक लेजर बीम पर ध्यान केंद्रित करके बनता है (चित्रा 1 बी)। परिणामी उत्सर्जन को एक ही एपर्चर के माध्यम से वापस केंद्रित किया जाता है और एक डाइक्रोइक दर्पण के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है (पूर्ण योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 सी )। यह तब किसी भी आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को हटाने के लिए और एक हिमस्खलन फोटोडायोड (एपीडी) पर पिनहोल के माध्यम से केंद्रित होता है। जब एपीडी एक फोटॉन का पता लगाता है, तो यह एक टीटीएल पल्स आउटपुट करता है, जिसका समय पिकोसेकंड रिज़ॉल्यूशन तक रिकॉर्ड किया जा सकता है। कॉन्फोकल वॉल्यूम के आसपास के क्षेत्र के भीतर इन स्वतंत्र रूप से अलग अणुओं का अवलोकन समय आमतौर पर मिलीसेकंड के क्रम के भीतर होता है।

चित्र1: माइक्रोस्कोपी और smfBox सेटअप के सिद्धांतों को दिखाने वाली योजनाबद्ध योजनाएं। (A) कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी सिद्धांत: उत्तेजना प्रकाश को उद्देश्य (Obj.) के किनारे में निर्देशित किया जाता है और कवरस्लिप-बफर इंटरफ़ेस पर कुल आंतरिक प्रतिबिंब से गुजरता है जो सतह से जुड़े अणुओं को उत्तेजित करने के लिए एक तेजी से क्षयकारी evanescence क्षेत्र उत्पन्न करता है। (बी) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी: स्वतंत्र रूप से विवर्तन करने वाले अणु नमूने में केंद्रित एक निकट विवर्तन-सीमित स्थान से उत्साहित होते हैं। (सी) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला smfBox सेटअप, सभी प्रमुख घटकों को दर्शाता है: हिमस्खलन फोटोडायोड (एपीडी), बीम स्प्लिटर (बीएस), डाइक्रोइक दर्पण (डीएम), फिल्टर (एफ), दर्पण (एम), उद्देश्य (ओ) और पिनहोल (पी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हाल ही में, smFRET तकनीकों में दो रंग उत्तेजना शामिल हैं, जहां दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना तरंग दैर्ध्य से मेल खाने वाले लेजर को वैकल्पिक किया जाता ^है5। यह दो तरीकों में से एक में किया जा सकता है, पहला KHz टाइमस्केल पर निरंतर तरंग लेजर को मॉड्युलेट करके, जिसे वैकल्पिक लेजर उत्तेजना (एलेक्स) ^13,14 के रूप में जाना जाता है। दूसरी विधि MHz टाइमस्केल पर तेजी से दालों interleaves; यह ^{nanosecond-ALEX15} या स्पंदित interleaved उत्तेजना (PIE)¹⁶ है. इन सभी दृष्टिकोणों में, स्वीकर्ता लेजर से जानकारी तथाकथित स्टोइकोमेट्री की गणना की ओर ले जाती है, जो कम FRET दक्षता वाले अणुओं और स्वीकर्ता की कमी वाले अणुओं के बीच भेदभाव कर सकती है (या तो अपूर्ण लेबलिंग या फोटोब्लीचिंग के माध्यम से)। पीआईई / एनएस-एलेक्स का उपयोग करना अतिरिक्त रूप से एकल-अणु स्तर पर फ्लोरोसेंट जीवनकाल तक पहुंच प्रदान करता है, और ध्रुवीकरण प्रकाशिकी के साथ युग्मित होने पर अनिसोट्रॉपी को मापा जा सकता है। माप के इस संयोजन को मल्टीपैरामीटर प्रतिदीप्ति का पता लगाने (MFD)⁹ के रूप में जाना जाता है।

SMFRET के कई फायदों के बावजूद, वाणिज्यिक उपकरणों की उच्च लागत और सरल, स्व-निर्माण विकल्पों की कमी के कारण विशेषज्ञ प्रयोगशालाओं के बाहर इसका व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है। कम लागत वाले ओपनसोर्स माइक्रोस्कोपी के विकास की दिशा में एक बढ़ती प्रवृत्ति हो रही है और अन्य प्लेटफार्म हाल ही में उभरे हैं, जिनमें प्लैंकटनस्कोप ¹⁷, ओपनफ्लेक्स्योर माइक्रोस्कोप ¹⁸, फ्लेक्सिस्कोप ¹⁹, miCube20, liteTIRF21 और Squid22 शामिल हैं। इसमें अध्ययन smfBox का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, एक हाल ही में विकसित लागत प्रभावी confocal सेट-अप स्वतंत्र रूप से एकल अणुओं diffusing पर दो रंगों के बीच FRET दक्षता को मापने में सक्षम है। विस्तृत निर्माण निर्देश और सभी आवश्यक परिचालन सॉफ़्टवेयर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं: https://craggslab.github.io/smfBox/ ²³। SmfBox की ऑप्टिकल व्यवस्था को सस्ती और व्यापक रूप से सुलभ निर्माताओं से खरीदे गए आसानी से उपलब्ध घटकों से इकट्ठा किया जाता है, जबकि माइक्रोस्कोप बॉडी (एक मानक कॉन्फोकल सेट-अप में अधिकांश खर्च के लिए जिम्मेदार) को एक कस्टम लाइट-टाइट एनोडाइज्ड-एल्यूमीनियम बॉक्स द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है (परिवेश प्रकाश परिस्थितियों के तहत माप करने की अनुमति देता है)। इस बॉक्स में प्रमुख ऑप्टिकल घटक हैं, जिनमें उत्तेजना डाइक्रोइक, उद्देश्य और पिनहोल, और एक यांत्रिक लेजर इंटरलॉक शामिल हैं, जो कक्षा I लेजर उत्पाद के रूप में अपने सुरक्षित संचालन को सक्षम करते हैं (एक पूर्ण योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 सी देखें)। SmfBox एलेक्स का उपयोग करता है डाई stoichiometry मान्य करने के लिए और सटीक FRET सुधार कारकों को निर्धारित करने के लिए. यह कस्टम-लिखित, ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर (smOTTER) का उपयोग करके संचालित किया जाता है, जो डेटा अधिग्रहण के सभी पहलुओं को नियंत्रित करता है और कई तृतीय-पक्ष विश्लेषण उपकरणों के साथ संगत ओपन-सोर्स फोटॉन-HDF5 ^format24 में डेटा आउटपुट करता है। SmfBox और अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल हाल ही में एक बहु-प्रयोगशाला अंधा अध्ययन ²⁵ में >20 अन्य उपकरणों (confocal और TIRF दोनों) के खिलाफ परीक्षण किया गया था। प्राप्त FRET दक्षता अन्य सभी उपकरणों के साथ उत्कृष्ट समझौते में थे, smfBox व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेटअप की कीमत का केवल एक अंश लागत के बावजूद।

यहां, एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल को प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए रेखांकित किया गया है, जो कि smfBox का उपयोग करके डीएनए डुप्लेक्स को स्वतंत्र रूप से अलग करने पर सटीक, पूर्ण FRET दक्षताओं को प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए, सभी तरह से स्विच ऑन से, संरेखण और ध्यान केंद्रित करने के माध्यम से, डेटा संग्रह और विश्लेषण के लिए। यहां उपयोग किए जाने वाले नमूने तीन डुप्लेक्स डीएनए हैं (उच्च, मध्य और निम्न-FRET दक्षताओं को प्रदर्शित करते हुए, तालिका 1 देखें) जो दुनिया भर में अंधे अध्ययन ²⁵ में मूल्यांकन किए गए थे; हालांकि, विधि प्रोटीन और अन्य न्यूक्लिक एसिड सहित कई आणविक प्रणालियों के लिए अनुकूलहै। आशा है कि इस तरह के एक विस्तृत प्रोटोकॉल, ^smfBox23 के लिए पहले से ही मौजूदा निर्माण निर्देशों के साथ, इस शक्तिशाली तकनीक को प्रयोगशालाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए और भी अधिक सुलभ बनाने में मदद करेगा।

Protocol

1. पावर पर घटकों छह प्लग (कोई विशेष आदेश नहीं) पर शक्ति: Piezoconcept (z-focus), APD0, APD1, हरे लेजर, लाल लेजर और फोटोडिटेक्टर। 2. सॉफ्टवेयर 1-प्रयोगात्मक सेटअप लेजर नियंत्रण केंद्र लॉन्च करें। निरंतर तरंग सुनिश्चित करें – वैकल्पिक निरंतर वर्तमान (CW-ACC) मोड का चयन किया जाता है। दोनों लेजर पर शक्ति। लेजर शक्तियों की जाँच करें/ सेट करें।नोट: लेजर शक्ति को उत्तेजना डाइक्रोइक से ठीक पहले मापा गया के रूप में समायोजित करने की आवश्यकता होगी, क्योंकि उत्तेजना पथ में एनडी फिल्टर और बीम स्प्लिटर लेजर नियंत्रण कक्ष पर दी गई संख्या से लेजर शक्ति को कम कर देंगे। यहां दी गई संख्याएं उत्तेजना डाइक्रोइक पर शक्ति हैं, लेकिन लेजर नियंत्रण पर शक्ति जो इससे मेल खाती है, उसे काम करने की आवश्यकता होगी। 220 μW हरे रंग के लेजर (515 एनएम, 40 mW) लाल लेजर के लिए μ70 W (638 एनएम, 10 mW) smOTTER अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लेजर, डिटेक्टरों, जेड-स्टेज और कैमरा को कनेक्ट करें। उन्हें सही ढंग से कॉन्फ़िगर करें (विशेष NI कार्ड सेटअप की सेटिंग्स के आधार पर भिन्न हो सकता है)। 3. उत्सर्जन पथ का संरेखण (नियमित रूप से आवश्यक नहीं) संरेखण सेट करना पिपेट 10 मुक्त Cy3B डाई (~ 100 nM) माइक्रोस्कोप पर और ध्यान केंद्रित के रूप में नीचे दिए गए चरणों 4.3-4.5 में वर्णित है.नोट: स्वीकर्ता चैनल में कुछ रिसाव के साथ एक और दाता डाई भी काम करेगा। SMOTTER में संरेखण टैब खोलें, लेजर शक्ति को कम करें, और डिटेक्टरों से रीडआउट देखे जाने तक y-अक्ष पैमाने को बदलें।नोट:: यहाँ लक्ष्य संकेत को बढ़ाने के लिए है, इसलिए संकेत बढ़ जाता है के बाद पैमाने को फिर से बदलने की आवश्यकता हो सकती है। SmfBox के सामने चार शिकंजा unscrew और सामने पैनल को हटाने के लिए। पिनहोल संरेखण संरेखण टैब पर सिग्नल देखते समय पिनहोल पोजिशनर पर एक्स घुंडी को चालू करें, हरे और लाल रंग में सिग्नल को बढ़ाने की कोशिश कर रहे हैं। अब दूसरी दिशा में पिनहोल को संरेखित करने के लिए वाई घुंडी को घुमाएं। संकेत में किसी भी और वृद्धि के लिए जाँच करने के लिए एक्स घुंडी पर लौटें। पिनहोल-लेंस संरेखण लेंस एक्स घुंडी को एक दिशा में घुमाएं, यह सिग्नल को कम कर देगा। सिग्नल को फिर से बढ़ाने के लिए पिनहोल एक्स घुंडी को उसी दिशा में घुमाएं। यदि नया अधिकतम संकेत पहले की तुलना में अधिक है, तो उस दिशा में पिनहोल और लेंस दोनों को पुनरावृत्ति से स्थानांतरित करना जारी रखें। यदि यह पहले से कम है, तो पुनरावर्ती रूप से विपरीत दिशा में आगे बढ़ें। y के लिए ऊपर दोहराएं। APD लेंस संरेखण हरे रंग के एपीडी के साथ शुरू करते हुए, एक्स घुंडी को तब तक ले जाएं जब तक कि ग्रीन सिग्नल अधिकतम न हो जाए। y घुंडी के लिए दोहराएँ. एक्स घुंडी पर लौटें, दहलीज बिंदुओं को खोजने के लिए आगे और पीछे जाएं जहां सिग्नल गिरना शुरू हो जाता है, और इसे इन दो बिंदुओं के बीच आधे रास्ते में एक स्थिति में छोड़ दें। एक्स घुंडी के लिए दोहराएँ। लाल एपीडी लेंस के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएं, लाल सिग्नल देख रहे हैं। सामने पैनल smfBox पर वापस जगह और शिकंजा की जगह.नोट:: उपरोक्त संरेखण माहिल निष्पादित करें, और एक एहतियाती उपाय के रूप में यदि यह संदेह है कि माइक्रोस्कोप माप के बीच एक संरेखण दोष विकसित किया गया है। 4. माप-डेटा अधिग्रहण पहले नमूने के लिए, मेथनॉल में भिगोए गए लेंस सफाई ऊतक के साथ मंच को साफ करें; एक छोर से दूसरे छोर तक उद्देश्य के पार धीरे से पोंछें। उद्देश्य के केंद्र पर माइक्रोस्कोपी के लिए विसर्जन तेल की 3-4 बूँदें लागू करें; नमूनों के बीच आवश्यकतानुसार फिर से भरें। नमूना तैयारी पिपेट 10 μL नमूना (पहले उपयोग प्रकार मैं ultrapure पानी) एक साफ कवर ग्लास के केंद्र पर. कवर ग्लास और उद्देश्य के बीच हवा के बुलबुले को फँसाने से रोकने के लिए तेल के कोण पर इसे कम करने वाले उद्देश्य लेंस पर कवर ग्लास को ध्यान से रखें।नोट: यदि आवश्यक हो, तो केंद्र बिंदु से दूर तेल में हवा के बुलबुले को धक्का देने के लिए स्लाइड कवर ग्लास चारों ओर। वैकल्पिक-लेजर उत्तेजना (एलेक्स) प्रयोगों को करने के लिए लेजर ड्यूटी चक्र पैनल में लेजर को निम्नानुसार कॉन्फ़िगर करें। दाता (हरे रंग के लेजर) 0 बंद, 45 पर, 55 बंद स्वीकर्ता (लाल लेजर) 50 बंद, 45 पर, 5 बंद एलेक्स अवधि (μs): 100 रिबन में Z फ़ोकस टैब पर क्लिक करें; अधिग्रहण पैनल में, लाइव करने के लिए लेजर स्विच और कैमरा शुरू; एक्सपोजर को समायोजित करें ताकि एक उज्ज्वल स्थान केंद्रीय रूप से काले रंग से घिरा हुआ दिखाई दे।नोट: कैमरा कवरस्लिप और नमूने के बीच ग्लास / पानी इंटरफ़ेस द्वारा परावर्तित प्रकाश को कैप्चर करता है और प्रकाश का दृश्यमान सर्कल इस इंटरफ़ेस पर फोकल पॉइंट होने पर अपने सबसे छोटे व्यास पर होता है। इसलिए इस इंटरफ़ेस के नीचे शुरू करना आवश्यक है, इंटरफ़ेस के लिए जेड-ऊंचाई को बढ़ाएं, और फिर कवरस्लिप के ऊपर और मापा जा रहे नमूने में थोड़ा और ध्यान केंद्रित करने के लिए थोड़ा आगे बढ़ें। कम जेड स्थिति से शुरू करते हुए, ऊंचाई बढ़ाएं जब तक कि उज्ज्वल स्थान अपने न्यूनतम आकार तक नहीं पहुंच जाता है, फिर तेल के ऊपर लेजर पर ध्यान केंद्रित करने और ग्लास को कवर करने और नमूने में ऊंचाई को 20 μm तक बढ़ाता है। फोकस में एक बार कैमरा बंद करो। यह पुष्टि करने के लिए कि सेटअप उचित रूप से किया गया है, कोई प्रतिदीप्ति संकेत नहीं देखने के लिए टाइप I अल्ट्राप्योर पानी के ट्रेस की निगरानी करें; बफर जिसमें नमूने तैयार कर रहे हैं के लिए शुद्धता की पुष्टि दोहराएँ. हानिकारक उद्देश्य से बचने के लिए रबर-समाप्त चिमटी के साथ कवर ग्लास को सावधानीपूर्वक हटा दें, फिर उद्देश्य पर ऊपर के रूप में तैयार ब्याज का नमूना रखें। कवर ग्लास और उद्देश्य के बीच संपर्क के एक समान क्षेत्र को बनाए रखने के लिए आवश्यक के रूप में विसर्जन तेल को फिर से भरें (कवर ग्लास और उद्देश्य के फोकल क्षेत्र पर नमूने के संपर्क क्षेत्र पर विशेष ध्यान दिया गया) एकाग्रता बिंगो यह सुनिश्चित करने के लिए कि एकल-अणु डेटा प्राप्त किया जाता है, नमूनों को एक एकाग्रता पर होना चाहिए जिस पर एसएमओटीईआर के लाइव ट्रेस पैनल में प्रति सेकंड 1-5 फटने देखे जाते हैं (यह एक बार में पता लगाने की मात्रा में एक से अधिक अणुओं के मौजूद होने की संभावना को कम करता है)। उचित एकाग्रता निर्धारित होने पर माप लें। लंबे प्रयोगों के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए, एक एयरटाइट नमूना कक्ष तैयार करें। सिलिकॉन आइसोलेटर्स (8-9 मिमी व्यास छेद) को कवर ग्लास के केंद्र पर नीचे दबाएं (एक पिपेट टिप के साथ रंगीन-इन)। फिर, ध्यान से केंद्र में एक नमूना पिपेट करें, सिलिकॉन के साथ किसी भी संपर्क से बचें। फिर, शीर्ष पर एक दूसरा कवर ग्लास रखें और एक सील बनाने के लिए दबाएं। लाइव स्टोइकोइमेट्री बनाम FRET दक्षता (ES) हिस्टोग्राम की जांच करें यह देखने के लिए कि क्या नमूना अपेक्षित रूप से व्यवहार कर रहा है, यानी, अपेक्षित FRET दक्षता और उचित स्टोइकोमेट्री (~ 0.5)। जब नमूना तैयार हो जाता है, तो सहेजें सेटिंग्स पैनल में प्रयोग के लिए विवरण दर्ज करें। सहेजें सेटिंग्स पैनल में ellipsis आइकन (hdf5/h5 स्वरूप में सहेजी गई फ़ाइलें) पर क्लिक करके एक उपयुक्त निर्देशिका और फ़ाइल नाम चुनें। नमूना नाम, नमूना विवरण, दाता और स्वीकर्ता लेबल, बफर, दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, पता लगाने तरंग दैर्ध्य और लेजर शक्ति, और उपयोगकर्ता और उपयोगकर्ता संबद्धता के लिए जानकारी दर्ज करें। रिबन में लाइव ट्रेस टैब पर वापस जाएँ, और अधिग्रहण पैनल में प्रयोग लंबाई (मिनटों में) दर्ज करें, त्रुटि के मामले में संभावित डेटा-हानि को कम करने के लिए एक उपयुक्त सहेजने के अंतराल का चयन करें। यदि आवश्यक हो, तो लेजर पावर सहेजें का चयन करें। डेटा लेने के लिए प्रारंभ दबाएँ .नोट: सटीक FRET निर्धारण को सक्षम करने के लिए, कम से कम दो नमूनों को एक ही दाता और स्वीकर्ता रंजक युक्त मापा जाना चाहिए, लेकिन पर्याप्त रूप से अलग FRET क्षमता के साथ। 5. विश्लेषण / सॉफ्टवेयर 2 FRETBursts पायथन पैकेज के साथ Jupyter नोटबुक लॉन्च करें (सेटअप निर्देश यहां पाए जा सकते हैं: https://craggslab.github.io/smfBox/anasoftware.html) यदि निरपेक्ष FRET दक्षता के लिए सुधार की आवश्यकता नहीं है (यानी, FRET में केवल सापेक्ष परिवर्तन माप के लिए पर्याप्त हैं) लॉन्च Jupyter नोटबुक FRET विश्लेषण 1.4 Uncorrected.ipynb। आगे के विश्लेषण या अन्य सॉफ़्टवेयर में प्लॉटिंग के लिए CSV फ़ाइलों के रूप में आंकड़े या डेटा निर्यात करने के लिए इसका उपयोग करें।नोट:: प्रत्येक नोटबुक विश्लेषण कार्यविधियों के माध्यम से उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करने के लिए विस्तृत निर्देश हैं। विश्लेषण प्रक्रियाओं की अधिक विस्तृत चर्चा के लिए, जिसमें बर्स्ट खोज एल्गोरिदम, पृष्ठभूमि सुधार और सभी सुधार पैरामीटर शामिल हैं, देखें23,25. यदि निरपेक्ष FRET दक्षता के लिए सुधार की आवश्यकता है, तो crosstalk पैरामीटर अल्फा (स्वीकर्ता चैनल में दाता उत्सर्जन का रिसाव) और डेल्टा (दाता उत्तेजना के तहत स्वीकर्ता के प्रत्यक्ष उत्तेजना का अनुपात) की गणना करके शुरू करें। सबसे पहले Jupyter नोटबुक सुधार कारक खोजक अल्फा-Delta.ipynb लॉन्च और अल्फा और डेल्टा पैरामीटर निर्धारित करें।नोट:: यदि ये नमूनों के बीच असंगत हैं, तो माइक्रोस्कोप ने माप के बीच एक संरेखण समस्या विकसित की हो सकती है या रंजक का स्पेक्ट्रा नमूनों के बीच भिन्न होता है। यदि अल्फा और डेल्टा पैरामीटर सुसंगत हैं, तो गामा और बीटा पैरामीटर (जो रंजक के बीच उत्तेजना और पता लगाने की क्षमता में अंतर के लिए खाते हैं) को निर्धारित करने के लिए जुपिटर नोटबुक सुधार कारक खोजक गामा-बीटा.ipynb लॉन्च करें।नोट: यदि गामा और बीटा प्लॉट अच्छी तरह से फिट नहीं होता है, तो माइक्रोस्कोप ने माप, या क्वांटम पैदावार के बीच एक संरेखण समस्या विकसित की हो सकती है, या रंजक के विलुप्त होने के गुणांक नमूनों के बीच भिन्न होते हैं। निर्धारित चार crosstalk पैरामीटर के साथ, इन कारकों का उपयोग FRET विश्लेषण 1.4 Corrected.ipynb Jupyter नोटबुक में पूर्ण FRET दक्षता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। 6. समस्या निवारण यदि सभी संकेत कम हैं या प्रति बर्स्ट की गिनती अपेक्षा से कम है (यह डाई निर्भर है- लेकिन ATTO-550 और ATTO-647N के लिए smfBox पर विशिष्ट मान एक एकल-अणु फटने के दौरान प्रति एमएस 50 और 100 गिनती के बीच हैं), smfBox को फिर से संरेखित करें। ईएस हिस्टोग्राम पर दोगुना और एकल लेबल वाली आबादी के बीच पुल।नोट: यह या तो बहुत अधिक एकाग्रता पर काम करने के कारण हो सकता है (नमूना को पतला करके उपाय), या फोटोब्लीचिंग द्वारा, जो बहुत अधिक लेजर पावर का उपयोग करके हो सकता है (लेजर शक्ति को कम करके इसका उपाय)। यदि विस्फोट दर पूरे प्रयोग के दौरान गिरती है (फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए अणु संभवतः ग्लास कवरस्लिप का पालन कर रहे हैं), तो सुधार करने के लिए बीएसए की बढ़ी हुई एकाग्रता का उपयोग करें। यदि पूरे प्रयोग में फटने की दर बढ़ जाती है (नमूना वाष्पीकरण की संभावना है), तो ऊपर वर्णित एक एयर-टाइट नमूना कक्ष तैयार करें। यदि संरेखण के दौरान सिग्नल शून्य पर दुर्घटनाग्रस्त हो जाता है (सॉफ़्टवेयर को डिटेक्टरों से सिग्नल द्वारा अभिभूत किया जा रहा है), तो लेजर पावर को कम करें या अधिक पतला संरेखण नमूने का उपयोग करें। यदि जेड-फोकस संकेंद्रित छल्ले दिखाता है (यदि उद्देश्य पर कई कवरस्लिप रखे गए हैं तो ऐसा हो सकता है), तो उद्देश्य पर कई कवरलिप्स की जांच करें। यदि नमूने में मध्यवर्ती स्टोइकोमेट्री के उज्ज्वल, लंबे फटने (एकत्रित अणुओं के कारण) होते हैं, तो डिटर्जेंट का उपयोग करें या नमूना शुद्धिकरण प्रोटोकॉल को संशोधित करें।नोट: एक साफ बफर प्राप्त करना एक समस्या हो सकती है, क्योंकि कुछ बफर घटकों में अक्सर बहुत कम मात्रा में मामूली फ्लोरोसेंट संदूषक होते हैं जो समय ट्रेस पर एकल रंग फटने के रूप में प्रस्तुत करने के लिए पर्याप्त होते हैं। यदि बफर में इसका बहुत अधिक है, तो यह नमूना फटने के साथ मेल खा सकता है और FRET दक्षता या स्टोइकोमेट्री को मापा जा रहा है। विशेष रूप से बीएसए अक्सर इस संबंध में समस्याग्रस्त हो सकता है, इसलिए संदूषकों को फोटोब्लीच करने के लिए एक मजबूत प्रकाश स्रोत के लिए स्टॉक बीएसए समाधान को उजागर करना सहायक होता है।

Representative Results

प्रोटोकॉल को सेटअप के दौरान प्रयोगात्मक स्थितियों के महत्वपूर्ण मूल्यांकन की आवश्यकता होती है (प्रोटोकॉल चरण 4.8 देखें)। प्राप्त किए गए पहले परिणाम जो प्रयोग की सफलता या विफलता को निर्धारित करते हैं, इस चरण में प्राप्त किए जाते हैं। एक सकारात्मक परिणाम प्रति सेकंड पांच और एक फटने के बीच होगा ( चित्रा 2 बी, सी देखें)। एक नकारात्मक परिणाम उस समय सीमा के भीतर बहुत अधिक (चित्रा 2 ए) या बहुत कम फटने (चित्रा 2 डी) होगा। इन त्रुटियों को सुधारने के लिए इस स्तर पर यह संभव है: बहुत अधिक एकाग्रता वाले नमूने को बस पतला करने की आवश्यकता है; यदि एकाग्रता बहुत कम है, हालांकि, एक नया नमूना तैयार करने की आवश्यकता हो सकती है (निर्धारक यह है कि क्या यह उचित समय सीमा में डेटा एकत्र करने के लिए इस कम एकाग्रता पर संभव रहता है)। चित्रा 2: प्रयोगात्मक सेटअप के दौरान लाइव ट्रेस से स्क्रीन शॉट्स डबल लेबल वाले डुप्लेक्स डीएनए नमूनों की विभिन्न सांद्रता दिखाते हैं। (ए) बहुत अधिक, (बी) ऊपरी स्वीकार्य सीमा, (सी) लक्ष्य एकाग्रता, (डी) बहुत कम। फोटॉन गिनती (1 एमएस डिब्बे) तीन डिटेक्शन चैनलों में दिखाए जाते हैं; दाता उत्तेजना (डीडी) के बाद दाता उत्सर्जन, दाता उत्तेजना (डीए) के बाद स्वीकर्ता उत्सर्जन, और स्वीकर्ता उत्तेजना (एए) के बाद स्वीकर्ता उत्सर्जन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. एक स्थिर एकल-प्रजाति प्रणाली को आमतौर पर मजबूत डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक आवश्यक ~ 1,000 फटने को प्राप्त करने के लिए 30 से 60 मिनट के माप की आवश्यकता होती है। समय की लंबाई और आवश्यक फटने की संख्या कई प्रजातियों या गतिशील प्रणालियों के साथ बढ़ेगी। प्रोटोकॉल आंकड़ों का उपयोग करके डेटा संग्रह और विश्लेषण के बाद Jupyter नोटबुक्स से निर्यात किए जाते हैं। alternation प्लॉट (चित्रा 3A) प्रयोगात्मक सेटअप की एलेक्स अवधि से मेल खाना चाहिए। समय ट्रेस (चित्रा 3 बी) का उपयोग गुणात्मक रूप से आकलन करने के लिए किया जाता है कि नमूना एकाग्रता उचित है। पृष्ठभूमि प्लॉट (चित्रा 3 C) पृष्ठभूमि दर 26 का अनुमान लगाने के लिए लंबे समय तक रैखिक फिट के साथ अंतर-फोटॉन देरी अवधि के वितरण को दर्शाता है। पृष्ठभूमि ट्रेस (चित्रा 3 डी) यह पहचान सकता है कि क्या प्रयोग की अवधि में नमूने में परिवर्तन हुए थे; मुख्य रूप से यह लंबे समय तक अधिग्रहण समय के दौरान वाष्पीकरण के कारण होगा। ईएस हिस्टोग्राम सभी फोटॉनों (चित्रा 3 ई) और दोगुना लेबल वाली प्रजातियों (चित्रा 3 एफ) के लिए उत्पन्न होते हैं। अंत में, एक 1 डी ई हिस्टोग्राम (चित्रा 3 जी) फट डेटा के गाऊसी फिटिंग के साथ उत्पन्न होता है। चित्र 3: Jupyter नोटबुक्स द्वारा उत्पन्न विश्लेषण किए गए डेटा का उदाहरण आंकड़ा आउटपुट। (A) Alternation plot, (B) Time trace, (C) Background determination, (D) Background rates, (E) All photon ES हिस्टोग्राम, (F) Dual channel ES हिस्टोग्राम, और (G) 1D E हिस्टोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. नाम अनुक्रम 1a 5 ‘- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT TTT GAG TGT TTG TCT GG – 3′ 3′- सीटीसी जीएसी टीटीटी सीएसी एजीसी टीसीए एएसी एएए सीटीसी एसीए एएएसी आगा सीसी – 5’ 1b 5 ‘- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT TTT GAG TGT TTG TCT GG – 3′ 3′- सीटीसी जीएसी टीटीटी सीएसी एजीसी टीसीए एएसी एएए सीटीसी एसीए एएएसी आगा सीसी – 5’ 1c 5 ‘- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT TTT GAG TGT TTG TCT GG – 3′ 3′- सीटीसी जीएसी टीटीटी सीएसी एजीसी टीसीए एएसी एएए सीटीसी एसीए एएएसी आगा सीसी – 5’ तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले डीएनए अनुक्रम। न्यूक्लियोटाइड्स को नीले और लाल रंग में हाइलाइट किया गया है जो क्रमशः एटो -550 और एटो -647 एन के साथ लेबल किए गए सी 2 अमीनो संशोधित थायमिन अवशेषों का प्रतिनिधित्व करते हैं। सुधार कारक खोजक अल्फा-डेल्टा: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें। सुधार कारक खोजक गामा-बीटा: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें। FRET Analysis 1.4 Corrected: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें। FRET विश्लेषण 1.4 Uncorrected: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम माइक्रोस्कोप का संरेखण और नमूना एकाग्रता को सही कमजोर पड़ने के लिए समायोजित कर रहे हैं। यदि संरेखण बंद है, तो फटने और प्लॉट हिस्टोग्राम की पहचान करने के लिए अपर्याप्त संकेत हो सकता है, और यदि नमूनों के बीच misalignment होता है तो सटीक FRET सुधार रिसाव और पता लगाने / उत्तेजना क्षमता में परिवर्तन के कारण विफल हो सकता है। एक उपयुक्त एकाग्रता का उपयोग भी महत्वपूर्ण है, बहुत अधिक एकाग्रता संयोग फटने देगी, जिसमें संभावित रूप से अलग-अलग फ्रेट दक्षताओं या लेबलिंग स्टोइकोमेट्री के साथ कई अणु शामिल हैं। बहुत कम एकाग्रता मजबूत डेटा विश्लेषण के लिए बहुत कम फटने देगी।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल स्थैतिक एकल FRET प्रजातियों में दूरी को मापने के लिए है। यदि नमूने में FRET दक्षता हिस्टोग्राम में एक से अधिक चोटी है, या चोटियां व्यापक दिखाई देती हैं (जो गतिशील प्रजातियों के साथ हो सकती हैं), तो हिस्टोग्राम को सटीकता की एक ही डिग्री में फिट करने के लिए अधिक फटने की आवश्यकता हो सकती है। दो अच्छी तरह से अलग चोटियों के लिए तो लगभग दो बार के रूप में ज्यादा डेटा की आवश्यकता होगी, लेकिन अगर आबादी थोड़ा ओवरलैप तो और भी अधिक डेटा की आवश्यकता है.

यदि दो आबादी प्रयोग के समय पैमाने पर परस्पर परिवर्तित होती है, तो सिस्टम की गतिशीलता और कैनेटीक्स संभावित रूप से निर्धारित किया जा सकता है। ^{BVA27 और 2CDE28} जैसे परीक्षण इस बात की पुष्टि कर सकते हैं कि मध्यवर्ती फटने प्रकृति में गतिशील हैं, जबकि dPDA29,30 या ^H2MM31 सहित विश्लेषण अंतर-रूपांतरण की दरों को निर्धारित कर सकते हैं। BVA और 2CDE के लिए Jupyter नोटबुक FRETBursts26 वेबसाइट पर उपलब्ध हैं, और MATLab आधारित सॉफ़्टवेयर ^PAM32 BVA, 2CDE और PDA विश्लेषण चला सकते हैं।

Confocal एकल अणु FRET आसानी से राज्यों को टीआईआरएफ की तुलना में बहुत अधिक अल्पकालिक (~ 1 एमएस) का निरीक्षण कर सकता है; हालांकि, प्रसार द्वारा सीमित लघु अवलोकन समय, कोई आणविक इतिहास नहीं देते हैं, और इसलिए लंबे समय तक रहने के समय, या जटिल संक्रमण नेटवर्क को उस तरह से निर्धारित नहीं कर सकते हैं जिस तरह से सतह स्थिर प्रयोग कर सकते हैं।

जैसा कि प्रोटोकॉल बहुत कम सांद्रता पर अणुओं को स्वतंत्र रूप से अलग करने के उपाय करता है, यह एक ही अणु पर इंट्रामोलेक्यूलर दूरी को मापते समय सबसे अच्छा काम करता है। क्षणिक रूप से बाध्य अणुओं के बीच अंतर-आणविक दूरी को मापा जा सकता है बशर्ते कि दो अणुओं का _केडी पर्याप्त रूप से कम हो कि परिसर प्रयोग द्वारा आवश्यक कम काम करने वाली एकाग्रता (~ 100 पीएम) पर एक महत्वपूर्ण मात्रा में मौजूद हो। यदि _केडी इससे बहुत अधिक है, तो केवल एकल लेबल वाले अणुओं को देखा जाएगा। इस समस्या को माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करके दो लेबल घटकों को एक साथ एक उच्च एकाग्रता पर मिश्रण करने के लिए दूर किया जा सकता है और फिर जटिल विघटित होने से पहले उद्देश्य पर तेजी से पतला और बहरहा ^है33,34।

एकल-अणु स्तर पर FRET दक्षताओं को मापने का पहनावा तकनीकों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है, क्योंकि यह विषम उप-आबादी पर सूचित करता है, जो एक पहनावा प्रयोग में औसत होगा। इसके अलावा, एलेक्स के साथ एकल-अणु FRET सटीक FRET दक्षता तक पहुंच प्रदान करता है, जिसे सटीक दूरी में परिवर्तित किया जा सकता है। यह केवल सापेक्ष दूरी परिवर्तनों की जांच करने के बजाय अधिक विस्तृत संरचनात्मक जानकारी के निर्धारण को सक्षम बनाता है। SmfBox इन सभी लाभों और क्षमताओं को वहन करता है, लेकिन confocal ^smFRET23 के लिए सक्षम तुलनीय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोप की तुलना में बहुत कम बजट पर बनाया जा सकता है।

SmfBox smFRET तकनीकों के लिए प्रवेश करने के लिए एक बहुत कम बाधा का प्रतिनिधित्व करता है, जिससे शोधकर्ताओं को संरचनात्मक परिवर्तनों को मापने की अनुमति मिलती है, और प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के भीतर और उनके बीच सटीक दूरी 7,8,9,10,11,35।

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों ने निम्नलिखित वित्त पोषण स्रोतों को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार किया है: BBSRC (BB/ T008032/1); EPSRC (बीए के लिए Studentship) और MRC (ए. आर.-टी. के लिए Studentship)।

Materials

Amino modified oligonucleotide	Eurogentec	N/A	May be ordered from various suppliers or synthesised; amino modification enables labeling with NHS-ester modified dyes
Avalanche photodiode (APD)	Excelitas	SPCM-AQRH-14	Two APDs are required for the smfBox setup
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A2153	System dependant; imaging buffer component (0.1 mg/mL in buffer)
Compact Laser Combiner	OMICRON	LightHUB-2	515 nm (80 mW) and 638 nm (100 mW) lasers
Coverglass	VWR	630-2742	Thickness: 0.17 ± 0.01 mm, LxW: 22×22 mm
Cy3B	Cytiva	PA63101	1 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg)
FRETBursts Python Package	N/A	N/A	Open-source python package for burst analysis of freely-diffusing single-molecule FRET data: https://fretbursts.readthedocs.io
Imaging Buffer	N/A		System dependant; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7.5 and 0.1 mg/mL BSA
Immersion Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Jupyter notebooks	Project Jupyter	N/A	Open-source web application to create and share documents that contain live code, equations, visualizations and text; data analysis notebooks for smfBox can be found in the SI
Lens Tissue	ThorLabs	MC-5	MC-50E is same item in bulk
Magnesium Chloride	Merck	M2670	System dependant; imaging buffer component (20 mM in buffer)
MilliQ/Ultrapure water	N/A
Nanopoistioner	Piezoconcept	FOC300	Nanopositioner for accurate positioning of microscope objective
NHS-ester modified ATTO-550	ATTO-TEC	AD 550-31	1 mg, AD 550-35 (5 mg)
NHS-ester modified ATTO-647N	ATTO-TEC	AD 647N-31	1 mg, AD 647N-35 (5 mg)
Objective lens	Olympus	N1480700	Olympus objective series from orignal smfBox discontinued; replaced by N5702300
OMICRON Control Center (OCC)- laser control center	OMICRON	N/A	v3.5.34 – OMICRON laser driver software
Press-To-Seal silicone isolator	Grace Bio-Labs	664201	8-9 mm Diameter x 1.7 mm Depth
smOTTER	N/A	N/A	Open-source acquisition software for the Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER
Sodium Chloride	Merck	S7653	System dependant; imaging buffer component (5 mM in buffer)
Tris base	Merck	93362	System dependant; imaging buffer component (5 mM, pH 7.5 in buffer)
Type I ultrapure water	Merck	ZIQ7000T0	Milli-Q® IQ 7000 Ultrapure Water System

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Abdelhamid, M. A. S., Rhind-Tutt, A. V., Ambrose, B., Craggs, T. D. Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox. J. Vis. Exp. (173), e62378, doi:10.3791/62378 (2021).