מוצג כאן פרוטוקול פשוט להתמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגני מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוך כשבוע.
כלי הדם מופצים בכל מקום בתוך כל רקמות הגוף ומבצעים פונקציות מגוונות. לפיכך, נגזרת של תאי אנדותל וסקולריים בוגרים, המרפדים את לומן כלי הדם, מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים היא חיונית למגוון יישומים של הנדסת רקמות והתחדשות. in vivo, תאי אנדותל קדמוניים נגזרים מהשושלת המזודרמלית ומוגדרים לתת-סוגים ספציפיים, כולל עורקים, ורידים, נימים, המוגניים ולימפטיים. תאי אנדותל המוגניים מעניינים במיוחד מכיוון שבמהלך ההתפתחות הם מעוררים תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים, אשר לאחר מכן מייצרים את כל שושלות הדם לאורך החיים. לפיכך, יצירת מערכת ליצירת תאי אנדותל המוגניים במבחנה תספק הזדמנות לחקור את המעבר מהאנדותל-להמטופויטים, ועשויה להוביל לייצור ex vivo של מוצרי דם אנושיים ולהפחתת ההסתמכות על תורמים אנושיים. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים לגזירת תאי אנדותל אבניים וקדמוניים, לא תואר ייצור של תאי אנדותל המוגני מאופיינים היטב מתאי גזע אנושיים. כאן מוצגת שיטה לגזירת תאי אנדותל המוגני מתאי גזע עובריים אנושיים תוך כשבוע: פרוטוקול התמיינות עם תאי פס פרימיטיביים שנוצרו בתגובה למעכב GSK3β (CHIR99021), לאחר מכן אינדוקציה של שושלת מזודרם בתיווך bFGF, לאחר מכן התפתחות תאי אנדותל ראשוניים המקודמים על ידי BMP4 ו- VEGF-A, ולבסוף מפרט תאי אנדותל המוגני המושרה על ידי חומצה רטינואית. פרוטוקול זה מניב אוכלוסייה מוגדרת היטב של תאי אנדותל המוגני שניתן להשתמש בהם כדי להבין עוד יותר את הוויסות המולקולרי שלהם ואת המעבר האנדותל-להמטופוייטי, שיש לו פוטנציאל להיות מיושם על יישומים טיפוליים במורד הזרם.
תאי אנדותל (ECs) הם אוכלוסייה הטרוגנית של תאים המבצעים פונקציות מרובות בכל גוף האדם וברקמות מהונדסות. בנוסף לתמיכה וויסות סוגי תאים אחרים (כלומר, קרדיומיוציטים1, תאים אוסטאובלסטיים2), תפקודים אלה כוללים יצירת מחסום סלקטיבי בין הדם לרקמות וסיוע ביצירת רקמות3. הבחנה של ECs בוגרים במהלך התפתחות תקינה דורשת מסלולי איתות מגוונים. ECs קדמוניים נגזרים מאבות מזודרם, ולאחר מכן מוגדרים לעבר פנוטיפים עורקיים, ורידיים, נימיים ולימפתיים בוגרים4. בנוסף, תת-קבוצה קטנה של ECs בשק החלמון החוץ-עוברי ובאזור אבי העורקים-גונאד-מזונפרוס העוברי (AGM) מוגדרים גם הם כ-ECs המוגניים, אשר מעוררים תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) הנודדים לכבד העוברי ולמח העצם העוברי, שם הם נשארים לאחר הלידה ומייצרים את כל סוגי תאי הדם לאורך החיים4. המגוון המגוון של פנוטיפים של EC חיוני לכל פיתוח ותחזוקה של רקמות.
לפיכך, ECs ונגזרותיהם הם מרכיבים קריטיים במחקרים שמטרתם מידול, והבהרת מנגנונים של, התפתחות אנושית ו / או מחלה, כמו גם רפואה רגנרטיבית ויישומי הנדסת רקמות 5,6,7,8. עם זאת, המגבלה העיקרית עבור סוגים אלה של מחקרים היא חוסר הזמינות של ECs אנושיים ראשוניים בכמות הנדרשת. ההערכה היא כי מינימום של 3 x 108 ECs יידרש עבור רוב היישומים הטיפוליים6. כדי לפתור בעיה זו, הוצע השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ובתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) בשל פוטנציאל השושלת המגוון שלהם ויכולתם לייצר מספר גדול של צאצאים 6,9.
ואכן, התועלת של תאים שמקורם בתאי גזע עובריים או hiPSCs הוכחה במחקרים רבים שהתמקדו במידול מחלות ובבדיקת תרופות10,11,12. טכנולוגיית איבר על שבב (OOC) שימשה כדי לשחזר בצורה נאמנה יותר את הפיזיולוגיה של גוף האדם על ידי שילוב תאים ורקמות בפיגומים תלת-ממדיים. יתר על כן, חיבור של מספר OOCs בודדים (מה שמכונה גוף או אדם על שבב, BOC/HOC) יכול להתבצע באמצעות מיקרופלואידיקה כדי לאפשר הצלבה בין האיברים המעניינים13,14,15. רקמות תומכות, כגון כלי הדם, הן מרכיבים קריטיים של OOCs ו- BOC / HOCs; שילוב כלי הדם מאפשר הובלה של חומרים מזינים, חמצן וגורמים פרקריניים ברחבי הרקמות, ובכך מקדם את המיקרו-סביבה הספציפית לרקמותהנדרשת 3,12. לפיכך, שיטות לגזירת ECs אנושיים בוגרים, כגון ECs עורקיים, ורידיים, לימפתיים והמוגניים, הן חיוניות לקידום גישות הנדסת רקמות אלה.
פורסמו פרוטוקולים מרובים המפרטים שלבים לנגזרת של ECs קדמוניים או אבות אנושיים מ- hESCs או hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . רבים מהפרוטוקולים הללו מסתמכים על היווצרות גוף עוברי (EB) או על תרבית משותפת של תאי גזע עובריים/iPSCs עם שכבת הזנה מורין של תאים סטרומליים. אסטרטגיות אלה נוטות להיות קשות וגוזלות זמן, עם תפוקות EC נמוכות ו / או זיהום של ECs אנושיים עם תאי מורין. פרוטוקולים המסתמכים אך ורק על תרבית דו-ממדית ללא שימוש בתאים סטרומליים דורשים לעתים קרובות אינדוקציות ארוכות, משתמשים בשילובים מורכבים של גורמי גדילה ו/או מעכבים לצורך אינדוקציה, יש תקופות התרחבות ממושכות לאחר הפרדת תאים, או שילוב של גורמים אלה. קידום הידע על מסלולי איתות וגורמים המעורבים בגזירת סוגי EC בוגרים in vivo מספק את הקרקע לפרוטוקול בידול חוץ גופי פשוט וחזק.
בעבר זוהו תפקידי מפתח עבור מסלולי איתות של Notch וחומצה רטינואית (RA) במפרט של ECs עורקיים והמוגני של מורין, בהתאמה, במהלך הפיתוח. מסלול האיתות Notch ממלא תפקידים מרובים במפרט ובתחזוקה של פנוטיפ EC עורקי. עבודה באמצעות מודל כלי הדם ברשתית מורין זיהתה מסלול שבו לחץ גזירה נוזלי משרה ציר איתות Notch-Cx37-p27, המקדם מעצר מחזור תאי G1, המאפשר מפרט EC עורקי27. ההשערה היא שמצבי מחזור התא ממלאים תפקיד בהחלטות על גורל התא על ידי מתן חלונות הזדמנויות ברורים שבהם התאים פתוחים לאותות מסוימים שיכולים לגרום לביטוי גנים ולשינויים פנוטיפיים28. מעצר G1 זה בתיווך Notch איפשר ביטוי של גנים המועשרים ב-ECs עורקיים, כולל אפריןB2, Cx40, DLL4, Notch1 ו-Notch 4 (שנסקרב-29,30). כמו כן, הוכח כי מפרט EC המוגני מקודם in vivo באמצעות איתות RA31,32. מחקרים נוספים זיהו כי, במורד הזרם של איתות RA, ביטוי של c-Kit ו- Notch מעלה את p27, המאפשר מפרט המוגני בשק החלמון מורין וב- AGM33. ניתן לזהות באופן מינימלי ECs המוגני של מורין על ידי ביטוי של סמני אנדותל (כלומר, CD31, KDR) והמטופויאטיים (כלומר, c-Kit, CD34)4. לבסוף, ECs המוגני עוברים מעבר אנדותל-להמטופוייטי (EHT) ליצירת HSPCs, אשר יכול להוליד את כל סוגי תאי הדם 4,34,35.
עבודות אחרונות בדקו אם אותה היררכיית איתות יכולה לקדם מפרט EC המוגני אנושי. לשם כך, פותח פרוטוקול תרבית דו-ממדית ללא סרום ומזין להפקת ECs המוגניים מ-hESCs, ו-ECs המוגניים אלה אופיינו ברמת תא יחיד כ-CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin– CD45–. מחקר זה ניצל גם את הכתב מחוון מחזור תא יוביקוויטינציה פלואורסצנטי (FUCCI), המזהה מצבי מחזור תאים שונים, תוך שימוש ב- H9-hESCs המבטאים את מבנה כתב FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. במחקרים עם תאים אלה, הוכח כי RA מקדם מעצר מוקדם של מחזור תאי G1 ב-ECs, ומצב G1 מוקדם מאפשר אפיון המוגני במבחנה37. כאן, פרוטוקול מפורט להתמיינות של תאי אנדותל המוגני אנושיים אלה ובדיקות המאשרות את זהותם מסופקים. שיטה פשוטה זו מספקת אמצעי שימושי ליצירת תת-קבוצה מיוחדת זו של ECs למחקרים עתידיים של מנגנונים של התפתחות תאי דם אנושיים.
להלן מפורטים השלבים להפקת תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע עובריים אנושיים תוך כשבוע באמצעות מערכת תרבית דו-ממדית נטולת מורין וסרום (איור 1). פרוטוקול זה מרחיב על שיטה המתוארת על ידי Sriram et al. (2015) כדי להשיג ECsראשוני 38. האופי הראשוני ופוטנציאל המפרט של CD31+ CD45-</…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענקי NIH HL128064 ו- U2EB017103. תמיכה נוספת ניתנה על ידי מענק CT Innovations 15-RMB-YALE-04.
15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
Cell Detatchment Solution Brand Name: vAccutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 mg/cm2 |
GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. |