Summary
Menselijke nier tubuloïde culturen vertegenwoordigen een waardevol in vitro model om nierfysiologie en ziekte te bestuderen. Tubuloïden kunnen worden vastgesteld uit nierweefsel (gezond en ziek) en urine, waarbij de laatste een gemakkelijk te verkrijgen en minder invasieve bron van onderzoeksmateriaal vertegenwoordigt.
Abstract
Volwassen stamcel (ASC)-afgeleide menselijke nierepitheelorganoïden, of tubuloïden, kunnen met hoge efficiëntie worden vastgesteld uit gezond en ziek nierepitheel. Normale nier tubuloïden recapulleren vele aspecten van hun weefsel van oorsprong. Ze vertegenwoordigen verschillende nefronsegmenten - met name van de proximale tubulus, lus van Henle, distale tubuli en verzamelkanaal - en kunnen worden gebruikt om de normale nierfysiologie te bestuderen. Bovendien vergemakkelijkt tubuloïde technologie het modelleren van ziekten, bijvoorbeeldvoor infectieziekten en voor kanker. Het verkrijgen van nierepitheelcellen voor tubuloïdegeneratie is echter afhankelijk van overgebleven chirurgisch materiaal (zoals gedeeltelijke) nefrectomieën) of naaldbiopten. Het vermogen om tubuloïden uit urine te laten groeien zou een alternatieve, minder invasieve bron van gezonde nierepitheelcellen bieden. Het is eerder aangetoond dat tubuloïde culturen met succes kunnen worden gegenereerd uit slechts een paar milliliter vers verzamelde urine. Dit artikel beschrijft de protocollen voor het genereren en verspreiden van ASC-afgeleide menselijke nier tubuloïde culturen uit weefsel- en urinemonsters.
Introduction
Nieren vervullen de functie van systemisch regelen van de balans van lichaamsvloeistoffen. De aantasting van hun fysiologische functie kan worden veroorzaakt door verschillende factoren, waaronder diabetes, hypertensie en door geneesmiddelen geïnduceerde toxiciteit1. Voor een beter begrip van de normale nierfysiologie en de ontwikkeling van nierziekten is het gebruik van representatieve preklinische modellen cruciaal. In de afgelopen jaren zijn verschillende in vitro niermodellen gegenereerd op basis van de zogenaamde organoïde technologie2. Organoïden zijn driedimensionale, meercellige structuren die lijken op de morfologie en fysiologie van het weefsel (normaal of ziek) waaruit ze afkomstig zijn. Ze kunnen worden gegenereerd uit pluripotente (PSC's) of volwassen stamcellen (ASC's), elk met hun eigen kenmerken en toepassingen.
Psc-afgeleide nierorganoïden bootsen nefrogeneesena 3,4,5. Ze kunnen ook worden vastgesteld uit patiënt-afgeleide toegewijde cellen door geforceerde dedifferentiatie (geïnduceerde pluripotentie of iPSC). iPSC's kunnen vervolgens worden gedifferentieerd in de verschillende celtypen van het nefron, de functionele eenheid van de nier, door tijdige blootstelling aan specifieke groeifactorcocktails. Tijdens het creëren van een vrij compleet mini-orgaan in een schaal, blijft hun oprichting tijdrovend en vanwege het herprogrammeringsprotocol kunnen iPSC's vatbaar zijn voor ongewenste genetische instabiliteit6. Bovendien zijn iPSC-organoïden niet in staat om volledig te rijpen tot volwassen niercellen, waardoor een transcriptoomprofiel wordt onthuld dat lijkt op de foetale nier in een vroeg ontwikkelingsstadium7.
Van ASC afgeleide menselijke nier tubuloïden is aangetoond dat ze de vernieuwing van volwassen nierepitheel recapiuleren. Ze vertegenwoordigen voornamelijk de proximale tubulus, lus van Henle, distale tubuli en verzamelkanaal, zoals bevestigd door de expressie van verschillende transporteiwitten8,9,10. Het tubuloïde kweekprotocol zorgt voor de snelle uitbreiding van patiënt-afgeleid nierweefsel, met behoud van een stabiel genoom. Onderzoekstoepassingen omvatten het bestuderen van normale nierfysiologie, nefrotoxiciteit, drugstesten, evenals ziektemodellering8,10,11,12. Een mogelijke beperking van de vestiging van van patiënten afgeleide organoïde culturen, waaronder tubuloïden, is de beschikbaarheid van vers weefsel. Verschillende rapporten hebben echter aangetoond dat urine kan dienen als een bron voor nierepitheelcellen, waardoor een veel eenvoudigere, minder invasieve strategie wordt geboden om patiëntenmateriaal voor tubuloïde culturen te verkrijgen8,13,14. Inderdaad, het is onlangs aangetoond dat tubuloïden kunnen worden gekweekt uit urine8. Dit artikel beschrijft de oprichting en het onderhoud van tubuloïde culturen uit nierweefsel en urine.
Protocol
OPMERKING: De hierin beschreven experimenten zijn goedgekeurd door de medisch ethische commissie van het Erasmus Medisch Centrum (Rotterdam) en prinses Máxima Centrum voor Kinderoncologie (Utrecht).
1. Generatie van menselijke nier tubuloïden uit weefsel
- Materiaal
- Voorwarm multiwell weefselkweekplaten (6, 12 en 24 putten) 's nachts bij 37 °C.
- Bereid basaal medium (AdDF +++) door toevoeging van 1x L-alanine / L-glutamine supplement, 1% w / v 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethaansulfonzuur (HEPES, 10 mM), en 1% Penicilline / Streptomycine antibiotica aan Advanced DMEM / F12.
- Bereid kweekmedium voor door 1,5% B27-supplement, 10% R-spondin-geconditioneerd medium, epidermale groeifactor (50 ng / ml), fibroblastgroeifactor-10 (100 ng / ml), N-acetylcysteïne (1,25 mM), Rho-kinaseremmer Y-27632 (10 μM), breedspectrumantibiotica (0,1 mg / ml) en A83-01 (5 μM) toe te voegen aan AdDF +++. Verwarm voor gebruik tot 37 °C.
- Bereid het keldermembraanextract (BME) door een aliquot een nacht bij 4 °C te ontdooien. Houd de BME op ijs tijdens de procedure.
- Bereid collagenaseoplossing voor door collagenase te verdunken tot een eindconcentratie van 1 mg/ml in AdDF+++, met toevoeging van 10 μM Y-27632. Warm op tot 37 °C.
- Bereid petrischalen van 10 cm, scalpels en pincetten. Desinfecteer het keukengerei door gedurende 20 minuten een ultraviolette lamp aan te brengen, gevolgd door wassen met desinfectiemiddel, demi-water en 70% v / v ethanol. Droog het keukengerei aan de lucht.
- Verwarm een horizontale shaker voor op 37 °C.
- Procedure
- Verzamel nierweefsel in een buis van 50 ml gevuld met 30-40 ml AdDF +++ medium. Plaats het stukje weefsel in ~1 ml medium in een petrischaaltje van 10 cm. Gehakt het weefsel in stukjes van ~ 1 mm3 grootte met behulp van scalpels (Figuur 1A).
- Breng het gehakte weefsel over in een buis van 15 ml met behulp van een tang en scalpels. Voeg 5 ml AdDF+++ toe aan de petrischaal, was en verzamel het medium met een steriele pipet van 10 ml. Breng al deze inhoud over naar dezelfde buis.
- Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Voeg 3-4 ml collagenase-oplossing toe aan de buis van 15 ml. Verplaats de buis naar een horizontale shaker ingesteld op 37 °C en een snelheid van 250 rpm.
- Controleer na de eerste 15 minuten incubatie het monster en schud de buis krachtig. Herhaal dit totdat de suspensie homogeen is en de meeste stukjes weefsel zijn verdwenen, met een maximale incubatietijd van 45-60 min. (Figuur 1B).
- Vul de buis met AdDF+++, en meng door de buis 5-10x om te keren. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Als de pellet rood is, gaat u verder met stap 1.2.6. Ga anders naar stap 1.2.8.
- Voeg 1 ml lysisbuffer voor rode bloedcellen (zie de tabel met materialen)toe aan de celkorrel. Tik voorzichtig op de buis om de pellet opnieuw te suspenden (niet resuspend met pipetpunt). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Vul de tube met AdDF+++. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Als er nog steeds bloedcellen zichtbaar zijn, herhaalt u de procedure nogmaals, te beginnen met stap 1.2.6. Ga anders verder met stap 1.2.8.
- Als er op dit punt van het protocol brokken weefsel zichtbaar zijn, gaat u verder met stap 1.2.8. Ga anders verder met de meting van het pelletvolume in stap 1.2.9. Voeg 5 ml AdDF+++ toe aan de buis en resuspend met een steriele pipet van 10 ml. Filter de suspensie door een 100 μm nylon cel zeef geplaatst op een 50 ml buis.
- Breng de gefilterde suspensie over naar een nieuwe buis van 15 ml. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Meet het volume van de celkorrel met een p1000-pipet die is ingesteld op een bekend volume. Pipetteer voorzichtig op en neer om te resuspend zonder luchtbellen te creëren. Breng de buis gedurende 1 minuut over op ijs.
- Voeg 70-75% volume BME toe aan de pellet. Resuspend met behulp van een p1000- of p200-pipet en plaat 15 μL druppels in een voorgewarmde, multiwell celkweekplaat (6, 12 of 24 putten, gebaseerd op het totale platingvolume (<100 μL, 24 putten; 100-200 μL, 12 putten; >200 μL, 6 putten)).
- Draai de plaat ondersteboven en laat de plaat 15-20 min in de couveuse rusten bij 37 °C(figuur 1C). Voeg voorgewarmd kweekmedium toe en inspecteer de culturen(figuur 1C,D).
2. Generatie van menselijke nier tubuloïden uit urine
OPMERKING: Urine is een vijandige omgeving voor cellen. Voor een succesvolle uitvoering van dit protocol is het belangrijk dat urinemonsters zo snel mogelijk worden verwerkt, bij voorkeur binnen 4 uur na uitscheiding. In de tussentijd moeten urinemonsters bij 4 °C worden bewaard.
- Materiaal
- Voorwarm multiwell weefselkweekplaten (6, 12 en 24 putten) 's nachts bij 37 °C.
- Wasmedium bereiden: AdDF+++ aangevuld met breedspectrumantibiotica (0,1 mg/ml) en 10 μM Y-27632.
- Bereid cultuurmedium voor zoals hierboven beschreven. Warm voor gebruik op bij 37 °C.
- Bereid een BME-matrix voor. Blijf op ijs tijdens de procedure.
- Procedure
- Verzamel een urinemonster en verdeel het gelijkmatig in buizen van 50 ml(figuur 2A-I). Voeg 10-20 ml wasmedium toe aan elk van de buizen. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C (figuur 2A-II) en verwijder het bovennatuurlijk voorzichtig.
- Voeg 10 ml wasmedium toe aan elk van de buizen. Reuspens de pellets voorzichtig met behulp van een steriele pipet van 10 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C (figuur 2A-III) en verwijder het bovennatuurlijk voorzichtig.
- Resuspend de pellets en breng de inhoud van alle buizen over in één buis van 15 ml. Vul de tube met wasmedium. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C (figuur 2A-IV) en verwijder het supernatant.
- Meet het volume van de celkorrel met een p1000-pipet die is ingesteld op een bekend volume. Pipetteer voorzichtig op en neer om te resuspend zonder luchtbellen te creëren. Breng de buis gedurende 1 minuut over op ijs.
- Voeg 70-75% volume van de BME toe aan de pellet. Resuspend met behulp van een p1000- of p200-pipet en plaat 15 μL druppels in een voorgewarmde, multiwell celkweekplaat (6, 12 of 24 putten, gebaseerd op het totale platingvolume (<100 μL, 24 putten; 100-200 μL, 12 putten; >200 μL, 6 putten)).
- Draai de platen ondersteboven in de couveuse gedurende 15-20 min bij 37 °C. Voeg voorgewarmd kweekmedium toe en inspecteer de culturen(figuur 2B).
3. Uitbreiding van tubuloïde culturen
OPMERKING: Tubuloïde culturen kunnen ongeveer elke 1-2 weken worden gepasseerd met een splitverhouding van 1: 2-1: 3. Ze kunnen meestal worden uitgebreid voor ongeveer 15 passages, met lijnspecifieke variaties.
- Materiaal
- Voorwarm multiwell weefselkweekplaten (6, 12 en 24 putten) 's nachts bij 37 °C.
- Bereid basaal medium (AdDF+++) en houd het tijdens de procedure op ijs.
- Bereid cultuurmedium voor zoals eerder beschreven. Warm voor gebruik op tot 37 °C.
- Bereid de BME-matrix voor en blijf tijdens de procedure op ijs.
- Bereid trypsinevervangend middel met toevoeging van Y-27632 tot een concentratie van 10 μM. Warm vóór gebruik op tot 37 °C.
- Autoclaaf niet-gefilterde p10 tips.
- Koel de centrifuge tot 4 °C.
- Procedure
- Verstoor de druppels met de tubuloïden door op en neer te pipetteren met een p1000-pipet met behulp van het medium dat in de put aanwezig is. Gebruik de punt om de bodem van de put te schrapen en zorg ervoor dat u alle cellen verzamelt die aan de bodem zijn bevestigd.
- Verzamel de inhoud in een buis van 15 ml. Voeg 10 ml AdDF+++ toe. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant.
- Voeg op basis van de grootte van de pellet trypsinevervangend middel aangevuld met 10 μM Y-27632 toe. Gebruik 1 ml trypsinevervangend middel voor 200 μl BME-druppels die tubuloïden bevatten. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 min.
- Gebruik een p1000 pipet met punt en plaats een niet-gefilterde, steriele p10-tip over de punt van 1000 μL. Pipetteer 20-30x op en neer om de organoïden mechanisch te verstoren.
- Controleer onder de microscoop of er nog veel intacte organoïden in de buis aanwezig zijn(figuur 3A). Als op dit punt meer dan 10% van de intacte organoïden aanwezig is, herhaal dit dan nogmaals van de incubatie van 5 minuten in stap 3.2.3 tot de microscopische waarneming voor intacte organoïden in stap 3.2.5. Ga anders verder met stap 3.2.6.
- Vul de tube met AdDF+++. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Meet het volume van de celkorrel met een p1000-pipet die is ingesteld op een bekend volume. Pipetteer voorzichtig op en neer om te resuspend zonder luchtbellen te creëren. Breng de buis gedurende 1 minuut over op ijs.
- Voeg 70-75% volume BME toe aan de pellet. Resuspend met behulp van een p1000- of p200-pipet en plaat 15 μL druppels in een voorgewarmde, multiwell celkweekplaat (6, 12 of 24 putten, gebaseerd op het totale platingvolume (<100 μL, 24 putten; 100-200 μL, 12 putten; >200 μL, 6 putten)).
- Draai de platen ondersteboven en laat de plaat 15-20 min rusten in de couveuse bij 37 °C. Voeg voorgewarmd kweekmedium toe en inspecteer de culturen(figuur 3B).
Representative Results
Voor nierweefsel verschijnen tubuloïde structuren meestal binnen 7 dagen na vaststelling(figuur 1D). Gebrek aan schijnbare groei binnen de eerste 7 dagen duidt op een onsuccesvolle uitkomst van het protocol. Over het algemeen moeten tubuloïde culturen binnen 1-2 weken na de eerste plating worden doorgang. Voor urine wordt de celgroei ongeveer 14-21 dagen na de vaststelling duidelijk, met het verschijnen van compacte tubuloïde structuren en / of aanhangende cellen op de bodem van de plaat (figuur 2B). Kweekoprichting is hoogstwaarschijnlijk mislukt als er binnen 4 weken na beplating geen groei kan worden gedetecteerd met een brightfieldmicroscoop. Voor van urine afgeleide culturen vindt de eerste passageing over het algemeen plaats tussen 3 en 4 weken. Terwijl in de eerste passages nier tubuloïde culturen voornamelijk bestaan uit compacte structuren, neemt de aanwezigheid van cystische epitheliale tubuloïden toe met de toename van het passageaantal (figuur 1D en figuur 2B). De succesvolle generatie van menselijke nier tubuloïde culturen kan worden beoordeeld door immunohistochemische kleuring uit te voeren voor markers die tot expressie komen in tubulair nierepitheel, zoals gepaard box gen 8-eiwit (PAX8) (Figuur 4A, B).
Figuur 1: Weefsel-afgeleide nier tubuloïde culturen. (A) Overzicht van de procedure om nierweefsel te gehakt. Weefsel wordt verkleind tot een grootte van ~ 1 mm3 met behulp van scalpels. (B) Voorbeeld van correcte enzymatische vertering van gezond nierweefsel. Weefsel wordt getoond vóór (links) en na (rechts) 45 minuten enzymatische spijsvertering met collagenase. Weinig stukjes weefsel zijn nog steeds zichtbaar aan de onderkant van de buis en de oplossing moet troebel worden, wat wijst op de aanwezigheid van cellen in de suspensie. (C) Representatief beeld van celkweekplaten na plating van BME-druppels die het verwerkte nierweefsel bevatten. Na het platen van de druppels worden kweekplaten ondersteboven (links) gedraaid en bij 37 °C in de couveuse geplaatst. Na 15-20 minuten wordt voorgewarmd kweekmedium aan de put toegevoegd (rechts). (D) Representatieve brightfield beelden van weefsel-afgeleide tubuloïde culturen. De eerste tubuloïde structuren worden 2-3 dagen na de eerste zaaiing zichtbaar. Met toenemende passageaantallen veranderen tubuloïden meestal de morfologie naar een meer cystisch fenotype. Schaalbalken = 300 μm. Afkortingen: BME = keldermembraanextract. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Urine-afgeleide nier tubuloid culturen. (A) Overzicht van urinemonster verwerking. Zo snel mogelijk na verzameling (I )worden urinemonsters verdeeld in buisjes van 50 ml en verdund in wasmedium (II). Na een tweede wasstap (III) wordt de inhoud van de buizen samengevoegd en wordt een derde en laatste wasstap (IV) uitgevoerd voordat de beplating wordt uitgevoerd. (B) Representatieve brightfield beelden van urine-afgeleide tubuloïde culturen. De eerste tubuloïde structuren en aanhangende cellen moeten binnen 21 dagen na de eerste beplating zichtbaar zijn. Schaalbalken = 300 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Passaging van nier tubuloïde culturen. (A) Representatief beeld van nier tubuloïde culturen na enzymatische spijsvertering. Na het voltooien van de spijsvertering mag niet meer dan 10% van de intacte tubuloïde structuren overblijven. Schaalbalk = 300μm. (B) Representatief beeld van nier tubuloïde culturen na plating. Inspectie van de culturen bevestigt dat het merendeel van de tubuloïden is verstoord. Schaalbalk = 300 μm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Histologische karakterisering van tubuloïde culturen. (A) H & E-kleuring van gezond nierweefsel en tubuloïden. Schaalstaven = 100 μm. (B) Immunohistochemie van PAX8 in normaal nierweefsel, tubuloïden, MRTK-weefsel en MRTK-organoïden. PAX8 positiviteit van de organoïde structuren bevestigt hun nierepitheel oorsprong. Gezond nierweefsel vertoont zowel positieve (tubuli) als negatieve structuren (glomeruli). MRTK-weefsel en organoïden werden opgenomen als negatieve controle. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; PAX8 = gepaard box gen 8; MRTK = kwaadaardige rabdoïde tumor van de nier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Organoïden worden beschouwd als avatars van het weefsel waarvan ze zijn afgeleid. Ze zorgen voor een snelle uitbreiding van patiëntmateriaal met behoud van de genotypische en fenotypische kenmerken van het weefsel van oorsprong15. Organoïde technologie heeft onlangs de deuren geopend voor de ontwikkeling van meer representatieve preklinische modellen, die kunnen worden gebruikt als belangrijke hulpmiddelen om bevindingen van de bank naar het bed te vertalen. Nier tubuloïden zijn veelbelovende in vitro modellen voor het testen van geneesmiddel-geïnduceerde nefrotoxiciteit, een veel voorkomende bijwerking van veel chemotherapeutische geneesmiddelen2,8,12. Als zodanig werd aangetoond dat patiënt-afgeleide tumororganoïde culturen voorspellend zijn voor de respons van de patiënt op de behandeling16,17,18. Het testen van geneesmiddelen op een high-throughput manier op tubuloïden maakt daarom mogelijk een betere definitie van therapeutische vensters mogelijk en vermindert het risico op door geneesmiddelen geïnduceerde nefrotoxiciteit bij patiënten.
Van veelgebruikte antibiotica is beschreven dat ze een toxisch effect op de nieren uitoefenen19. Hoewel de aanwezigheid van breedspectrumantibiotica noodzakelijk is voor de succesvolle vestiging van de culturen door besmetting te voorkomen, is het belangrijk om hun potentiële nefrotoxiciteit te overwegen. Hoewel er geen negatieve effecten van antibiotica zijn waargenomen op de vestiging van tubuloïde culturen, is verder onderzoek nodig om hun effecten grondig te evalueren. Tubuloïden kunnen worden gebruikt voor het bestuderen en modelleren van ziekten8. Ciliopathieën (pathologische disfunctie van trilharen) en andere genetische syndromen die de nier beïnvloeden, kunnen worden bestudeerd door tubuloïde lijnen rechtstreeks van getroffen proefpersonen te genereren, of door gezonde culturen te gebruiken waarin ziektespecifieke drivermutaties kunnen worden geïntroduceerd via CRISPR / Cas9-genoombewerking20.
Hoewel tubuloïden meercellige nierculturen zijn, missen ze verschillende nierceltypen, waaronder podocyten en endotheelcellen8. Bovendien hebben tubuloïden, in tegenstelling tot sommige andere van ASC afgeleide organoïdemodellen, een beperkt replicerend potentieel omdat ze ongeveer 15 passages kunnen worden gekweekt. Deze beperkte levensduur kan echter aanzienlijk worden verlengd door de toevoeging van Wnt aan het kweekmedium21. Verdere optimalisatie van het tubuloïde kweekprotocol is nodig om ze nog representatiever te maken voor de nier, inclusief meer gedifferentieerde celtypen. Hoewel de efficiëntie van tubuloïde vestiging uit weefselmonsters zeer hoog is (>95%), kan het in zeldzame gevallen falen. Er kunnen verschillende oorzaken zijn, waaronder: 1) slechte kwaliteit van het uitgangsmateriaal(bijv.Necrotisch weefsel als gevolg van medicamenteuze behandeling), 2) overdigestie van het weefselmonster of 3) besmetting van het primaire monster.
Om ervoor te zorgen dat de kwaliteit van de ontvangen weefselmonsters voldoende is om door te gaan met het protocol, is het belangrijk om nauw contact te houden met het pathologiepersoneel dat de evaluatie van het weefsel bij de operatie uitvoert. Als er voldoende materiaal beschikbaar is, moet de levensvatbaarheid ervan worden bevestigd door histologisch onderzoek(bijv.hematoxyline en eosinekleuring). Om cellysis tijdens enzymatische spijsvertering te voorkomen, is het bovendien belangrijk dat de incubatieprocedure niet langer is dan 1 uur. Ten slotte moeten antibiotica en antischimmelmiddelen aan de was- en kweekmedia worden toegevoegd om besmetting te voorkomen.
Urine kan geëfolide epitheelcellen bevatten die niet zijn afgeleid van de nier22, die de tubuloïde culturen kunnen besmetten. Deze omvatten bijvoorbeeld urotheelcellen die, in tegenstelling tot renale tubulaire cellen, positief zijn voor tumoreiwit P63 en negatief voor PAX88. Het wordt daarom aanbevolen om de culturen te testen op PAX8-positiviteit om de zuiverheid van gevestigde niertubulioïdelijnen te bevestigen voordat u doorgaat met vervolgexperimenten(figuur 4B).
Urine vertegenwoordigt een vijandige omgeving voor cellen als gevolg van hoge osmotische druk en lage pH. Voor het succes van het protocol is het daarom cruciaal dat monsters zo snel mogelijk bij het verzamelen van urine worden verwerkt. Als zodanig moet de verzamelde urine zo snel mogelijk worden verdund en uitgebreid worden gewassen met gebufferde oplossing om de aanwezigheid van levensvatbare cellen op het moment van zaaien te garanderen. Het slagingspercentage van tubuloïde-vestiging zal aanzienlijk afnemen als urine enkele uren vóór de verwerking wordt bewaard. Ten slotte heeft urine, hoewel steriel, een hoog risico op besmetting in verband met het verzamelproces. Het is daarom belangrijk om was- en groeimedium aan te vullen met antibiotica en antischimmelmiddelen. Wanneer rekening wordt gehouden met al het bovenstaande, kan een slagingspercentage van ongeveer 50% worden bereikt.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We bedanken alle patiënten en hun families voor hun deelname aan het onderzoek. We bedanken het klinische team dat ons onderzoek heeft gefaciliteerd. We zijn dankbaar voor de steun van de European Research Council (ERC) startsubsidie 850571 (J.D.), KWF Kankerbestrijding/Alpe d'HuZes Bas Mulder Award (nr. 10218, J.D.), Oncode Institute en Stichting Kinderen Kankervrij (KiKa nr. 292, C.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634010 | |
| antiPAX8 antibody | LSBio | LS-B13466 | |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | Stock of 50x, final concentration of 1x |
| BME | Trevigen | 3533-010-02 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C9407 | Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL |
| GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine | Gibco | 35050061 | Stock of 100x, final concentration of 1x |
| Hepes | Gibco | 15630106 | Stock of 1 M, final concentration of 10 mM |
| Multiwell tissue culture plates 12 wells | CELLSTAR | 665180 | |
| Multiwell tissue culture plates 24 wells | CELLSTAR | 662160 | |
| Multiwell tissue culture plates 6 wells | CELLSTAR | 657160 | |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140163 | Stock of 10.000 U/mL, final concentration of 100 U/mL |
| Primocin - broad-range antibiotics | Invivogen | ant-pm-1 | Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL |
| Red blood cells lysis buffer | Roche | 11814389001 | |
| RhoKinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817 | Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM |
| R-spondin conditioned medium | Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10% | ||
| TrypLe Express/ trypsin replacement agent | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
References
- Romagnani, P., et al.
- Ooms, A. H., Calandrini, C., de Krijger, R. R., Drost, J. Organoid models of childhood kidney tumours. Nature Reviews. Urology. 17 (6), 311-313 (2020).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Low, J. H., et al. Generation of human PSC-derived kidney organoids with patterned nephron segments and a de novo vascular network. Cell Stem Cell. 25 (3), 373-387 (2019).
- Little, M. H., Combes, A. N. Kidney organoids: accurate models or fortunate accidents. Genes & Development. 33 (19-20), 1319-1345 (2019).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Jun, D. Y., et al. Tubular organotypic culture model of human kidney. PLoS One. 13 (10), 0206447 (2018).
- Grassi, L., et al. Organoids as a new model for improving regenerative medicine and cancer personalized therapy in renal diseases. Cell Death & Disease. 10 (3), 1-15 (2019).
- Yousef Yengej, F. A., Jansen, J., Rookmaaker, M. B., Verhaar, M. C., Clevers, H.
- Calandrini, C., et al. An organoid biobank for childhood kidney cancers that captures disease and tissue heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 1310 (2020).
- Jansen, J., et al. A morphological and functional comparison of proximal tubule cell lines established from human urine and kidney tissue. Experimental Cell Research. 323 (1), 87-99 (2014).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080 (2012).
- Drost, J., Clevers, H.
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Morales-Alvarez, M. C.
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
- Dörrenhaus, A., et al. Cultures of exfoliated epithelial cells from different locations of the human urinary tract and the renal tubular system. Archives of Toxicology. 74 (10), 618-626 (2000).
