Isolering af mus interstitielle ventilceller til undersøgelse af forkalkning af aortaklappen In Vitro

Summary

I denne artikel beskrives isoleringen af musaortaklappeceller ved hjælp af en totrins kollagenprocedure. Isolerede museventilceller er vigtige for at udføre forskellige assays, såsom denne in vitro-forkalkningsanalyse, og for at undersøge de molekylære veje, der fører til aortaklappens mineralisering.

Abstract

Forkalkningen af aortaklappen celler er kendetegnende for aorta stenose og er forbundet med ventil cusp fibrose. Valve interstitial celler (VICs) spiller en vigtig rolle i forkalkningsprocessen i aorta stenose gennem aktivering af deres dedifferentiation program til osteoblast-lignende celler. Mouse VICs er et godt in vitro-værktøj til belysning af de signalveje, der driver mineraliseringen af aortaklappen. Den metode, der er beskrevet heri, og som disse forfattere har anvendt med succes, forklarer, hvordan man får frisk isolerede celler. Der blev udført en totrins kollagenprocedure med 1 mg/mL og 4,5 mg/mL. Det første skridt er afgørende for at fjerne det endotelcellelag og undgå forurening. Den anden kollagen inkubation er at lette migrationen af VICs fra vævet til pladen. Derudover diskuteres en immunfluorescens farvningsprocedure for fænotypekarakterisering af de isolerede museventilceller. Desuden blev forkalkningsanalysen udført in vitro ved hjælp af calciumreagensmålingsproceduren og alizarin rød farvning. Brugen af museventilcelle primærkultur er afgørende for test af nye farmakologiske mål for at hæmme cellemineralisering in vitro.

Introduction

Forkalket aortaklappen sygdom (CAVD) er den mest udbredte valvular hjertesygdom i vestlige populationer, der påvirker næsten 2,5% af ældre personer over 65 år¹. CAVD påvirker over seks millioner amerikanere og er forbundet med ændringer i de mekaniske egenskaber af foldere, der forringer normal blodgennemstrømning^1,2. I øjeblikket er der ingen farmakologisk behandling for at stoppe sygdommens progression eller for at aktivere mineralregression. Den eneste effektive behandling til behandling af CAVD er udskiftning af aortaklappen ved operation eller transkatheter aortaklappenudskiftning³. Det er derfor bydende nødvendigt at undersøge de molekylære mekanismer, der fører til ventilmineralisering, for at identificere nye farmakologiske mål. Faktisk har ikke-behandlet aorta stenose flere negative konsekvenser såsom venstre ventrikel dysfunktion og hjertesvigt⁴.

Aortaklappen består af tre lag kendt som fibrosa, spongiosa og ventriker, der indeholder VIC’er som den fremherskende celletype⁵. Fibrosaen og ventrikierne er dækket af et lag vaskulære endotelceller (VEC)⁵. VEC’erne regulerer gennemtrængeligheden af inflammatoriske celler samt parakrinesignaler. Øget mekanisk stress kan påvirke VEC’ernes integritet og forstyrre aortaklappens homøostase, hvilket fører til inflammatorisk celleinvasion⁶. Scanning af elektronmikroskopianalyser viste forstyrret endotel i en forkalket aortaventil hos mennesker⁷.

Histologiske analyser af forkalket væv afslører tilstedeværelsen af osteoblaster og osteoklaster. Desuden blev der observeret osteogen differentiering af VIC’er både in vitro og i humant ventilvæv⁸. Denne proces er hovedsageligt orkestreret af Runt-relaterede transskription faktor 2 (Runx2) og knoglen morfogenetiske proteiner (BMPs)^8,9.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Icahn School of Medicine på Mount Sinai institutionelle kerne og brug udvalg. 1. Forberedelse før ventilcelleisolering fra voksne mus Rengør og steriliser alle de kirurgiske instrumenter, der er vist i figur 1A, ved at bruge 70% v/v ethanol og efterfølgende autoklavere dem i 30 minutter. Der tilsættes 500 μL penicillin-streptomycin til 50 ml 10 mm HEPES. Forbered en al…

Representative Results

Da murin aortaklappen typisk er 1 mm i diameter, skal mindst tre ventiler samles for at indsamle en million levedygtige celler til forskellige forsøgsprocedurer. De forskellige trin i VIC-isolationsprocessen er vist i figur 1 og figur 2. Da det er vanskeligt manuelt at skrabe ventilvævet, er det at foretrække at bruge forskydningsstress skabt ved hvirvelstrømning for at fjerne VEC’erne. Resultaterne af cd31-immunfluorescensdætningen viste faktisk, at der ik…

Discussion

Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol over museventilcelleisolering til primær kultur. Tre aortaklapper fra 8 uger gamle mus blev samlet for at opnå et tilstrækkeligt antal celler. Derudover beskriver denne protokol karakteriseringen af VIC-fænotype og in vitro mineraliseringsanalysen. Metoden blev tilpasset fra den tidligere beskrevne protokol fra Mathieu et al.⁷.

Under isolering af aortaklapper skal man sørge for at undgå alle kild…

Materials

3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	25030081
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors – Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam