Denne artikkelen beskriver isolering av museaortaventilceller ved hjelp av en to-trinns kollagenalensprosedyre. Isolerte museventilceller er viktige for å utføre forskjellige analyser, for eksempel denne in vitro-forkalkningsanalysen, og for å undersøke de molekylære veiene som fører til aortaventilmineralisering.
Forkalkning av aortaventilceller er kjennetegnet på aortastenose og er forbundet med ventil cusp fibrose. Ventilinterstitielle celler (VICs) spiller en viktig rolle i forkalkningsprosessen i aortastenose gjennom aktivering av deres dedifferentiasjonsprogram til osteoblastlignende celler. Mouse VICs er et godt in vitro-verktøy for belysning av signalveiene som driver mineraliseringen av aortaventilcellen. Metoden beskrevet heri, vellykket brukt av disse forfatterne, forklarer hvordan du får tak i nyisolerte celler. En to-trinns kollagenalisseprosedyre ble utført med 1 mg/ml og 4,5 mg/ml. Det første trinnet er avgjørende for å fjerne endotelcellelaget og unngå forurensning. Den andre kollagenalinkubasjonen er å lette migreringen av VIC-er fra vevet til platen. I tillegg diskuteres en immunfluorescensfargingsprosedyre for fenotypekarakterisering av de isolerte museventilcellene. Videre ble forkalkningsanalysen utført in vitro ved hjelp av kalsiumreagensmålingsprosedyren og alizarin rød farging. Bruk av museventilcelle primærkultur er avgjørende for å teste nye farmakologiske mål for å hemme cellemineralisering in vitro.
Forkalket aortaklaffsykdom (CAVD) er den mest utbredte valvulære hjertesykdommen i vestlige populasjoner, som påvirker nesten 2,5% av eldre personer over 65 år1. CAVD påvirker over seks millioner amerikanere og er forbundet med endringer i de mekaniske egenskapene til brosjyrene som svekker normal blodstrømgjennomstrømning 1,2. For tiden er det ingen farmakologisk behandling for å stoppe sykdomsprogresjonen eller for å aktivere mineralregresjon. Den eneste effektive behandlingen for å behandle CAVD er aortaventilutskifting ved kirurgi eller transkateter aortaventil erstatning3. Det er derfor viktig å undersøke molekylære mekanismer som fører til ventilmineralisering for å identifisere nye farmakologiske mål. Faktisk har ikke-behandlet aortastenose flere negative konsekvenser som venstre ventrikel dysfunksjon og hjertesvikt4.
Aortaventilen består av tre lag kjent som fibrosa, spongiosa og ventrikulæris, som inneholder VICer som den dominerende celletypen5. Fibrosa og ventrikkel er dekket av et lag av vaskulære endotelceller (VECer)5. VECene regulerer permeabiliteten til inflammatoriske celler samt parakrinesignaler. Økt mekanisk stress kan påvirke integriteten til VECene og forstyrre homeostase av aortaventilen, noe som fører til inflammatorisk celleinvasjon6. Skanning av elektronmikroskopianalyser viste forstyrret endotel i en menneskelig forkalket aortaventil7.
Histologiske analyser av forkalket vev avslører tilstedeværelsen av osteoblaster og osteoklaster. Videre ble osteogen differensiering av VICs observert både in vitro og i humant ventilvev8. Denne prosessen er hovedsakelig orkestrert av Runt-relatert transkripsjonsfaktor 2 (Runx2) og benmorfogenetiske proteiner (BMPer)8,9.
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for museventilcelleisolasjon for primærkultur. Tre aortaventiler fra 8 uker gamle mus ble samlet for å oppnå et tilstrekkelig antall celler. I tillegg beskriver denne protokollen karakteriseringen av VIC fenotype og in vitro mineraliseringsanalysen. Metoden ble tilpasset fra den tidligere beskrevne protokollen fra Mathieu et al.7.
Under isolering av aortaventiler må det tas hensyn til å unngå a…
3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
CD31 | Novusbio | ||
Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
FBS | Gibco 16000044 | ||
Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
Vimentin | abcam |