Isolering av musinterstitiella ventilceller för att studera förkalkningen av aortaventilen in vitro
Summary
Denna artikel beskriver isoleringen av musaortaklaffceller genom en tvåstegs kollagenasprocedur. Isolerade musventilceller är viktiga för att utföra olika analyser, såsom denna in vitro-förkalkningsanalys, och för att undersöka de molekylära vägarna som leder till aortaventilmineralisering.
Abstract
Förkalkning av aorta ventil celler är kännetecknet för aorta pylorusstenos och är associerad med ventil cusp fibros. Ventil interstitiella celler (VICs) spelar en viktig roll i förkalkningsprocessen i aorta stenos genom aktivering av deras dedifferentieringsprogram till osteoblastliknande celler. Mus-VICs är ett bra in vitro-verktyg för att belysa signalvägarna som driver mineraliseringen av aortaventilcellen. Metoden som beskrivs häri, framgångsrikt används av dessa författare, förklarar hur man får nyisolerade celler. En tvåstegs collagenase förfarande utfördes med 1 mg/mL och 4,5 mg/mL. Det första steget är avgörande för att ta bort det endotelcellsskiktet och undvika förorening. Den andra kollageninkubationen är att underlätta migreringen av VIC från vävnaden till plattan. Dessutom diskuteras en immunofluorescens färgning förfarande för fenotyp karakterisering av isolerade mus ventil celler. Dessutom utfördes förkalkningsanalysen in vitro med hjälp av kalciumreagensmätningsförfarandet och alizarinröd färgning. Användning av musventil cell primär kultur är avgörande för att testa nya farmakologiska mål för att hämma cellmineralisering in vitro.
Introduction
Calcified aorta ventil sjukdom (CAVD) är den vanligaste valvular hjärtsjukdomar i västra populationer, påverkar nästan 2,5% av äldre individer över 65 år1. CAVD påverkar över sex miljoner amerikaner och är förknippat med förändringar i de mekaniska egenskaperna hos broschyrerna som försämrar normalt blodflöde genom1,2. För närvarande finns det ingen farmakologisk behandling för att stoppa sjukdomsförloppet eller aktivera mineralregression. Den enda effektiva behandlingen för behandling av CAVD är aorta ventil ersättning genom kirurgi eller transcatheter aorta ventil ersättning3. Det är därför absolut nödvändigt att undersöka de molekylära mekanismer som leder till ventilmineralisering för att identifiera nya farmakologiska mål. Faktum är att icke-behandlad aortastenos har flera negativa konsekvenser som vänster ventrikel dysfunktion och hjärtsvikt4.
Aortaventilen består av tre lager som kallas fibrosa, spongiosa och ventrikulära, som innehåller VIC som den dominerande celltypen5. Fibrosa och Ventrikulärt är täckta av ett lager av vaskulär endotelceller (VEC)5. VECs reglerar permeabiliteten hos inflammatoriska celler samt parakrina signaler. Ökad mekanisk stress kan påverka VECs integritet och störa aortaventilens homeostas, vilket leder till inflammatorisk cellinvasion6. Scanning elektronmikroskopi analyser visade stört endotel i en mänsklig calcified aorta ventil7.
Histologiska analyser av förkalkad vävnad avslöjar förekomsten av osteoblaster och osteoklaster. Osteogenic differentiering av VIC observerades dessutom både in vitro och i mänskliga ventil vävnad8. Denna process orkestreras huvudsakligen av Den Runt-relaterade transkriptionsfaktorn 2 (Runx2) och benmorfogenetiska proteiner (BMPs)8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här artikeln presenterar ett detaljerat protokoll för musventil cell isolering för primär kultur. Tre aorta ventiler från 8 veckor gamla möss var poolade för att få ett tillräckligt antal celler. Dessutom beskriver detta protokoll karakteriseringen av VIC fenotyp och in vitro mineralisering analys. Metoden anpassades från det tidigare beskrivna protokollet från Mathieu et al.7.
Under isoleringen av kolorektalventiler måste man se till …
Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. Medical treatment of aortic stenosis. Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
