ניתוח כלל-גנומי של הפצת שינויים בהיסטון באמצעות שיטת רצף האימונו-הוצאה כרומטין במגנפורטה אוריזה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את ההתפלגות הגנום של שינויים histone, אשר יכול לזהות גנים יעד חדשים בפתוגנזה של M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות.
Abstract
רצף immunoprecipitation Chromatin (ChIP-seq) היא טכניקה מולקולרית רבת עוצמה ונפוצה למיפוי מיקומי גנום שלמים של גורמי שעתוק (TFs), מווסתי כרומטין ושינויי היסטון, כמו גם זיהוי גנומים שלמים לחשיפת דפוסי כריכה TF ושינויים פוסט-טרנסלציה של histone. פעילויות לשינוי כרומטין, כגון מתילציה histone, מגויסים לעתים קרובות רצפים רגולטוריים גנים ספציפיים, גרימת שינויים מקומיים מבני כרומטין וכתוצאה מכך אפקטים שעתוק ספציפיים. פיצוץ האורז הוא מחלה פטרייתית הרסנית על אורז ברחבי העולם והוא מערכת מודל לחקר אינטראקציה פטרייה-צמח. עם זאת, המנגנונים המולקולריים באופן שבו השינויים histone לווסת הגנים virulence שלהם Magnaporthe oryzae להישאר חמקמק. חוקרים נוספים צריכים להשתמש ChIP-seq כדי לחקור כיצד שינוי אפיגנטי histone מווסת את הגנים היעד שלהם. ChIP-seq נמצא גם בשימוש נרחב כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבון ו- DNA בבעלי חיים וצמחים, אבל זה פחות בשימוש בתחום הפתולוגיה הצמחית ולא פותח היטב. במאמר זה, אנו מתארים את התהליך הניסיוני ואת שיטת הפעולה של ChIP-seq כדי לזהות את ההתפלגות הגנום כולו של מתילציה histone (כגון H3K4me3) שנקשרת לגנים היעד הפונקציונלי ב M. oryzae. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את ההתפלגות הגנום של שינויים histone, אשר יכול לזהות גנים יעד חדשים בפתוגנזה של M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות.
Introduction
אפיגנטיקה היא ענף של מחקר גנטי המתייחס לשינוי המשתי של ביטוי הגנים מבלי לשנות את רצף הנוקלאוטידים של הגנים. מספר גדל והולך של מחקרים הראו כי רגולציה אפיגנטית ממלאת תפקיד חשוב בצמיחה ובהתפתחות של תאים אאוקריוטים, כולל כרומטין המסדיר ומשפיע על ביטוי הגנים באמצעות התהליך הדינמי של קיפול והרכבה למבנים מסדר גבוה יותר1,2. שיפוץ כרומטין ושינוי histone קוולנטי משפיעים ומווסתים את התפקוד והמבנה של הכרומטין באמצעות וריאציה של פולימרים כרומטין, ובכך להשיג את הפונקציה של ויסות ביטויגנים 3,4,5,6. שינויים פוסט-יבשתיים של היסטון כוללים אצטילציה, זרחן, מתילציה, מונוביקוויטינציה, סומוילציה, ריבוזילציה ADP7,8,9. Histone H3K4 מתילציה, במיוחד טרימתילציה, מופתה לאתרי התחלת תמלול שבהם היא קשורה לשכפול תמלול, רקומבינציה, תיקון ועיבוד RNA באאוקריוטים10,11.
טכנולוגיית ChIP-seq הוצגה בשנת 2007 והפכה לסטנדרט הניסיוני לניתוח כלל הגנום של רגולציה תמלולית ומנגנונים אפיגנטיים12,13. שיטה זו מתאימה בקנה מידה רחב הגנום ולקבלת מידע אינטראקציה histone או גורם שעתוק, כולל מקטעי DNA של חלבונים מחייב DNA. כל רצפי דנ”א המקושרים לחלבונים מעניינים יעברו חלק מתסביך הכרומטין. טכניקות רצף מהדור החדש משמשות גם לרצף של 36-100 bp של DNA, אשר מותאמות לאחר מכן לגנום היעד המתאים.
בפטריות פיטופתיות, מחקרים החלו לאחרונה לחקור כיצד שינויים מתילציה histone לווסת את הגנים היעד שלהם בתהליך של פתוגניות. כמה מחקרים קודמים הוכיחו כי הרגולציה של גנים הקשורים histone מתילאז באה לידי ביטוי בעיקר השתקת גנים וזרז את הייצור של מטבוליטים משניים (SM). MoSet1 הוא מתילאז H3K4 ב M. oryzae. הסתרה של גן זה גורמת למחיקה מלאה של שינוי H3K4me314. בהשוואה לזן מסוג בר, הביטוי של הגן MoCEL7C במוטנט מעוכב במצב המושרה CMC ובמצב שאינו מושרה (גלוקוז או תאית), הביטוי של MoCEL7C גדל15. ב פוסאריום גרמינדרום, KMT6 יכול לזרז את שינוי המתילציה של H3K27me3, לווסת את ההתפתחות הרגילה של פטריות, ולעזור לווסת את “הגנום המסתורי” המכיל את אשכול הגנים SM16,17,18,19. בשנת 2013, קונולי דיווח כי H3K9 ו H3K27 מתילציה מסדיר את התהליך הפתוגניים של פטריות באמצעות מטבוליטים משניים וגורמי אפקט המסדירים את עיכוב של גנים היעד20. באספרגילוס, השינוי של היסטיונים H3K4me2 ו- H3K4me3 קשור להפעלת גנים וממלא תפקיד חשוב בשליטה על רמת הכרומטין רגולציה של אשכולות גנים SM21. ב M. oryzae, טיג1 (הומולוג ל-Tig1 בשמרים ויונקים) הוא ה-HADC (histone deacetylase)22. נוקאאוט של הגן Tig1 מוביל לאובדן מוחלט של פתוגניות ויכולת ייצור נבגים במוטנט האפס. זה רגיש יותר לסביבת peroxygen, אשר לא יכול לייצר hyphae זיהומי22.
פיצוץ האורז שנגרם על ידי M. oryzae. הוא אחת ממחלות האורז החמורות ביותר ברוב האזורים גידול אורז בעולם19. בשל תהליך ההדבקה הייצוגי שלה, M. oryzae דומה לתהליך ההדבקה של פטריות פתוגניות חשובות רבות. כפי שהוא יכול בקלות לבצע פעולות גנטיות מולקולריות, הפטרייה הפכה אורגניזם מודל לחקר אינטראקציות פטריות-צמח23. חסימת כל שלב של תהליך ההדבקה של M. oryzae עלולה לגרום לזיהום לא מוצלח. השינויים המורפולוגיים במהלך תהליך ההדבקה מוסדרים בקפדנות על ידי כל פונקציית הגנום ותעתיק הגנים. ביניהם, שינויים אפיגנטיים כגון מתיליציה histone לשחק תפקיד חיוני ברגולציה שעתוק של גנים פונקציונליים24,25. עם זאת, עד כה, מחקרים מעטים נעשו על המנגנון המולקולרי של שינויים אפיגנטיים כגון מתילציה histone ואצטילציה histone בתעתיק של פתוגנזה גנים M. oryzae. לכן, פיתוח נוסף של מנגנון הרגולציה האפיגנטית של פטריית פיצוץ האורז תוך כדי מחקר ברשת הרגולטורית במעלה ובמורד הזרם של הגנים הקשורים לפתוגניים אלה יסייע לפתח אסטרטגיות מניעה ובקרה של פיצוץ אורז.
עם התפתחות הגנומיקה התפקודית כגון ChIP-seq, במיוחד באפיגנטיקה, שיטת רכישת נתונים בעלת תפוקה גבוהה זו האיצה את המחקר על כרומוזומים. באמצעות הטכנולוגיה הניסיונית ChIP-seq, ניתן לזהות את ההפצה הרחבה של מתילציה של היסטון (כגון H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) ב- M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות. לכן, שיטה זו יכולה לעזור להדגיש את המנגנונים המולקולריים שבבסיס האופן שבו שינויים אפיגנטיים מווסתים את הגנים היעד המועמד שלהם במהלך פתוגנזה פטרייתית בפתולוגיה של הצמח.
Protocol
Representative Results
Discussion
לאחרונה, ChIP-seq הפך שיטת ניתוח גנומית בשימוש נרחב לקביעת אתרי הכריכה של TFs או אתרי העשרה שהשתנו על ידי היסטיונים ספציפיים. בהשוואה לטכנולוגיית ChIP-seq הקודמת, טכנולוגיית ChIP-seq החדשה רגישה וגמישה מאוד. התוצאות מסופקות ברזולוציה גבוהה ללא השפעות שליליות, כגון אות הרעש הנגרם על ידי הכלאה לא ספציפי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (Grant no. 31871638), פרויקט המחקר המדעי המיוחד של אוניברסיטת החקלאות של בייג’ינג (YQ201603), הפרויקט המדעי של ועדת החינוך של בייג’ינג (KM201610020005), פרויקט גידול המחקר המדעי ברמה גבוהה של BUA (GJB2021005).
Materials
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al. The mammalian epigenome. Cell. 128 (4), 669-681 (2007).
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
