Analisi a livello di genoma della distribuzione delle modificazioni isoniche utilizzando il metodo di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina in Magnaporthe oryzae
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la distribuzione a livello di genoma delle modifiche istoniche, che può identificare nuovi geni bersaglio nella patogenesi di M. oryzae e altri funghi filamentosi.
Abstract
Il sequenziamento dell’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) è una tecnica molecolare potente e ampiamente utilizzata per mappare le posizioni dell’intero genoma dei fattori di trascrizione (TF), dei regolatori della cromatina e delle modifiche istoniche, nonché per rilevare interi genomi per scoprire i modelli di legame TF e le modifiche post-traduzionali degli istoni. Le attività di modifica della cromatina, come la metilazione degli istoni, sono spesso reclutate in specifiche sequenze regolatorie geniche, causando cambiamenti localizzati nelle strutture della cromatina e con conseguenti effetti trascrizionali specifici. L’esplosione di riso è una malattia fungina devastante sul riso in tutto il mondo ed è un sistema modello per studiare l’interazione fungo-pianta. Tuttavia, i meccanismi molecolari nel modo in cui le modificazioni istoniche regolano i loro geni di virulenza in Magnaporthe oryzae rimangono sfuggenti. Più ricercatori devono utilizzare ChIP-seq per studiare come la modificazione epigenetica degli istoni regola i loro geni bersaglio. ChIP-seq è anche ampiamente usato per studiare l’interazione tra proteine e DNA negli animali e nelle piante, ma è meno utilizzato nel campo della patologia vegetale e non è stato ben sviluppato. In questo articolo, descriviamo il processo sperimentale e il metodo operativo di ChIP-seq per identificare la distribuzione a livello di genoma della metilazione degli istoni (come H3K4me3) che si lega ai geni bersaglio funzionali in M. oryzae. Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la distribuzione a livello di genoma delle modifiche istoniche, che può identificare nuovi geni bersaglio nella patogenesi di M. oryzae e altri funghi filamentosi.
Introduction
L’epigenetica è una branca della ricerca genetica che si riferisce al cambiamento ereditario dell’espressione genica senza modificare la sequenza nucleotidica dei geni. Un numero crescente di studi ha dimostrato che la regolazione epigenetica svolge un ruolo importante nella crescita e nello sviluppo delle cellule eucariotiche, compresa la cromatina che regola e influenza l’espressione genica attraverso il processo dinamico di ripiegamento e assemblaggio in strutture di ordine superiore1,2. Il rimodellamento della cromatina e la modificazione degli istoni covalenti influenzano e regolano la funzione e la struttura della cromatina attraverso la variazione dei polimeri di cromatina, ottenendo così la funzione di regolazione dell’espressionegenica 3,4,5,6. Le modificazioni post-traduzionali degli istoni includono acetilazione, fosforilazione, metilazione, monoubiquitinazione, sumoilazione e ribosilazione ADP7,8,9. La metilazione dell’istone H3K4, in particolare la trimetilazione, è stata mappata nei siti di inizio della trascrizione in cui è associata alla replicazione della trascrizione, alla ricombinazione, alla riparazione e all’elaborazione dell’RNA negli eucarioti10,11.
La tecnologia ChIP-seq è stata introdotta nel 2007 ed è diventata lo standard sperimentale per l’analisi genome-wide della regolazione trascrizionale e dei meccanismi epigenetici12,13. Questo metodo è adatto a livello di genoma e per ottenere informazioni sull’interazione tra istoni o fattori di trascrizione, compresi i segmenti di DNA delle proteine leganti il DNA. Qualsiasi sequenza di DNA reticolata a proteine di interesse coprecipita come parte del complesso della cromatina. Le tecniche di sequenziamento di nuova generazione vengono utilizzate anche per sequenziare 36-100 bp di DNA, che vengono poi abbinati al genoma bersaglio corrispondente.
Nei funghi fitopatogeni, la ricerca ha recentemente iniziato a studiare come le modificazioni della metilazione degli istoni regolano i loro geni bersaglio nel processo di patogenicità. Alcuni studi precedenti hanno dimostrato che la regolazione dei geni correlati all’istone metilasi si riflette principalmente nel silenziamento genico e nella catalizzazione della produzione di metaboliti secondari (SM). MoSet1 è la metilasi H3K4 in M. oryzae. Il knockout di questo gene provoca la delezione completa della modifica H3K4me314. Rispetto al ceppo wild-type, l’espressione del gene MoCEL7C nel mutante è inibita nello stato indotto da CMC e nello stato non indotto (glucosio o cellobiosio), l’espressione di MoCEL7C è aumentatadi 15. In Fusarium graminearum,KMT6 può catalizzare la modificazione della metilazione di H3K27me3, regolare il normale sviluppo dei funghi e aiutare a regolare il “genoma criptico” contenente il cluster di geni SM16,17,18,19. Nel 2013, Connolly ha riferito che la metilazione H3K9 e H3K27 regola il processo patogeno dei funghi attraverso metaboliti secondari e fattori effettori che regolano l’inibizione dei geni bersaglio20. In Aspergillus, la modifica degli istoni H3K4me2 e H3K4me3 è correlata all’attivazione genica e svolge un ruolo importante nel controllo della regolazione del livello di cromatina dei cluster genici SM21. In M. oryzae, Tig1 (omologo a Tig1 in lieviti e mammiferi) è un HADC (istone deacetilasi)22. Il knockout del gene Tig1 porta alla completa perdita di patogenicità e capacità di produzione di spore nel mutante nullo. È più sensibile a un ambiente perossigeno, che non può produrre ifeinfettive 22.
L’esplosione di riso causata da M. oryzae. è una delle più gravi malattie del riso nella maggior parte delle aree di coltivazione del riso nel mondo19. A causa del suo processo di infezione rappresentativo, M. oryzae è simile al processo di infezione di molti importanti funghi patogeni. Poiché può facilmente eseguire operazioni di genetica molecolare, il fungo è diventato un organismo modello per lo studio delle interazioni fungo-pianta23. Il blocco di ogni fase del processo di infezione di M. oryzae può causare un’infezione non riuscita. I cambiamenti morfologici durante il processo di infezione sono strettamente regolati dall’intera funzione del genoma e dalla trascrizione genica. Tra questi, le modificazioni epigenetiche come la metilazione degli istoni svolgono un ruolo essenziale nella regolazione trascrizionale dei geni funzionali24,25. Tuttavia, finora, sono stati condotti pochi studi sul meccanismo molecolare delle modificazioni epigenetiche come la metilazione degli istoni e l’acetilazione degli istoni nella trascrizione dei geni della patogenesi in M. oryzae. Pertanto, l’ulteriore sviluppo del meccanismo di regolazione epigenetica del fungo blasto del riso durante la ricerca sulla rete di regolazione a monte ea valle di questi geni patogeni aiuterà a sviluppare strategie di prevenzione e controllo dell’esplosione del riso.
Con lo sviluppo della genomica funzionale come ChIP-seq, specialmente in epigenetica, questo metodo di acquisizione dati ad alto rendimento ha accelerato la ricerca sui cromosomi. Utilizzando la tecnologia sperimentale ChIP-seq, è possibile identificare la distribuzione a livello di genoma della metilazione degli istoni (come H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) in M. oryzae e altri funghi filamentosi. Pertanto, questo metodo può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari alla base del modo in cui le modificazioni epigenetiche regolano i loro geni bersaglio candidati durante la patogenesi fungina nella patologia vegetale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recentemente, ChIP-seq è diventato un metodo di analisi genomica ampiamente utilizzato per determinare i siti di legame di TF o siti di arricchimento modificati da istoni specifici. Rispetto alla precedente tecnologia ChIP-seq, la nuova tecnologia ChIP-seq è altamente sensibile e flessibile. I risultati sono forniti in alta risoluzione senza effetti negativi, come il segnale di rumore causato dall’ibridazione non specifica degli acidi nucleici. Sebbene si tratta di un’analisi comune dell’espressione genica, molti metod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), dallo Special Scientific Research Project della Beijing Agriculture University (YQ201603), dal Scientific Project of Beijing Educational Committee (KM201610020005), dal progetto di coltivazione di ricerca scientifica di alto livello di BUA (GJB2021005).
Materials
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
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