질산염 및 아질산염 측정을 위한 쥐 골격근 균질액의 제조
Summary
우리는 질산염과 아질산염의 수준을 측정하고 비교하기 위해 쥐 골격근 조직의 4 가지 근육 그룹의 균질화를위한 세 가지 다른 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 또한 조직 샘플 크기가 균질화 결과에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 다양한 샘플 가중치를 비교합니다.
Abstract
질산염 이온 (NO3–)은 한때 산화 질소 (NO) 대사의 불활성 최종 생성물로 생각되었습니다. 그러나 이전의 연구는 질산염 이온이 2 단계 환원 메커니즘을 통해 포유류에서 NO로 다시 전환 될 수 있음을 입증했다 : 질산염은 주로 경구 공생 박테리아에 의해 아질산염 (NO2–)으로 환원되고, 아질산염은 헴 또는 몰리브덴 함유 단백질을 포함한 여러 메커니즘에 의해 NO로 환원된다. 이 환원성 질산염 경로는 특히 심혈관계 및 근육 운동 중에 NO 매개 신호 전달 경로를 향상시키는 데 기여합니다. 이러한 활용 전에 신체의 질산염 수준은 주로 식물에서 내인성 NO 산화 및식이 질산염 섭취의 두 가지 다른 원인에 의해 결정됩니다. 생리적 환경에서 복잡한 NO 순환을 설명하기 위해 우리는 NO에 비해 상대적으로 안정적인 대사 산물, 질산염 및 아질산염 이온의 역학을 추가로 조사했습니다. 이전 연구에서 골격근은 포유류에서 질산염 이온의 주요 저장 기관이자 운동 중 NO의 직접적인 공급원으로 확인되었습니다. 따라서 골격근에서 질산염 및 아질산염 수준을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 방법론을 수립하는 것이 중요하며 다른 조직 샘플로 적용을 확장하는 데 도움이 되어야 합니다. 이 논문은 질산염 및 아질산염 측정을 위해 세 가지 다른 균질화 방법을 사용하여 골격근 샘플의 준비를 자세히 설명하고 샘플의 크기를 포함하여 균질화 과정과 관련된 중요한 문제에 대해 논의합니다. 질산염과 아질산염 농도는 또한 4 개의 다른 근육 그룹에서 비교되었습니다.
Introduction
작은 기체 신호 분자인 산화질소(NO)는 생리학적 및 병리생리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다1. NO는 질산염 (NO 3-) 및 아마도 혈액 및 조직에서 아질산염 (NO2-)으로 빠르게 산화되기 전에 산화 질소 합성 효소 (NOS) 계열의 내인성 효소에 의해 L– 아르기닌으로부터 생성 될 수있다 2,3. 최근에, 이들 음이온은 포유류 시스템4에서 NO로 다시 환원되는 것으로 나타났다. 질산염은 주로 타액선에서 분비되고 직접 섭취되는 이온에 작용하는 구강 내 공생 박테리아 질산염 환원 효소 5에 의해 아질산염으로 전환되며, 어느 정도는 크 산틴 산화 환원 효소 6,7과 같은 포유류 효소에 의해 전환됩니다. 아질산염은 데옥시헤모글로빈8, 데옥시미오글로빈9, 몰리브덴 함유 효소(10) 및 양성자의 존재 하에서의 비효소적 환원(11,12)을 포함하는 여러 메커니즘에 의해 NO로 더 감소될 수 있다.
이 질산염-아질산염-NO 경로는 NOS가 NO 생성4에 산소를 필요로하기 때문에 NOS 활성이 감소하는 저산소 조건 하에서 강화됩니다. 최근의 많은 연구에서는 식이 질산염이 혈압 조절 및 운동 수행에 유익한 효과를 보고했으며, 이는 질산염 감소 경로가 NO 신호 전달13,14,15의 증가에 기여한다는 것을 시사합니다. 이전의 연구는 일부 골격근이 신체의 주요 질산염 저장 장소 일 가능성이 있음을 보여주었습니다16. 혈액이나 간과 같은 다른 내부 장기와 비교할 때 골격근 (대둔근)은 상당히 높은 수준의 질산염을 함유하고 포유류 신체에 상당한 질량을 가지고 있습니다. 트레드밀 운동은 쥐 모델7에서 아질산염과 둔근의 NO로의 질산염 감소를 향상시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 일부 골격근이 생리적 상황에서 질산염 환원 경로를 통해 NO의 중요한 공급원이 될 수 있음을 의미합니다. 보다 최근의 연구에 따르면 운동 중 근육 질산염 수준의 변화를 포함한 이러한 발견은 인간에서도 발생합니다17.
현재 저자 중 두 명은 이전에 혈액 및 기타 액체 샘플에서 질산염 및 아질산염 수준을 측정하는 방법을 확립했습니다18. 그러나 조직 균질액에서 이러한 음이온의 수준을 처음 분석했을 때 자세한 프로토콜을 사용할 수 없었습니다. 여러 기관에서 질산염-아질산염-NO 역학을 이해하기 위해 우리의 목표는 골격근을 포함한 포유류 조직에서 질산염 및 아질산염 수준을 측정하는 정확하고 효율적인 방법을 개발하는 것이 었습니다. 초기 연구에서, 설치류 조직은 신뢰할 수있는 균질화 공정을 개발 한 다음 이들 균질 물 7,16,19에서 질산염 및 아질산염 함량을 분석하는 데 사용되었다. 이 균질화 방법의 사용은 인간 골격근 생검 샘플로 확장되어 값이 확인되었으며, 중요한 것은 혈액/혈장과 비교하여 근육에 대해 관찰된 값이 설치류17에서 관찰된 값과 유사한 범위 및 비율에 있다는 것입니다. 최근 몇 년 동안 다른 그룹도 골격근 균질 액에서 질산염과 아질산염 수준을 측정하기 시작하여 우리 그룹20,21에서보고 한 것과 비슷한 값을보고했습니다.
이 프로토콜 논문의 목적은 질산염 및 아질산염 수준의 후속 측정을 위해 세 가지 다른 균질화 방법을 사용하여 골격근 균질액의 제조를 자세히 설명하는 것입니다. 또한, 골격근 샘플에서 질산염 및 아질산염 값에 대한 균질화에 사용 된 조직 중량의 영향을 조사했다. 우리는 이러한 방법이 다른 유형의 포유류 조직에 쉽게 적용될 수 있다고 믿습니다. 최근 특히 운동 생리학 분야에서는 근육 그룹에 따른 질산염 / 아질산염 / NO 생리학의 가능한 차이에주의를 기울였습니다. 우리는 또한 네 개의 다른 설치류 근육에서 질산염과 아질산염의 양을보고하고 이러한 다른 근육 사이에서 두 이온의 불균일 한 분포를 찾습니다. 추가 연구가 필요한 관찰.
Protocol
Representative Results
Discussion
생리적 개입의 기능으로 NO 대사 산물, 질산염 및 아질산염의 변화를 모니터링하려면 신진 대사에 중요한 여러 기관에서 이러한 이온의 수준을 측정하는 것이 필수적입니다. 혈액 내의 헤모글로빈은 NO 및 그 대사 산물과 반응하므로 가능한 한 조직 샘플에서 혈액을 신속하게 제거하는 것도 중요합니다. 따라서 골격근 조직 (대둔근, TA, EDL, 비복근)을 수집하기 전에 동물을 식염수로 관류시키고 표?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 교내 NIH / NIDDK 보조금 ZIA DK 0251041-14에서 Alan N Schechter, MD에게 지원되었습니다.
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
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