تحضير تجانس عضلات الهيكل العظمي للفئران لقياسات النترات والنتريت
Summary
نقدم بروتوكولات لثلاث طرق مختلفة لتجانس أربع مجموعات عضلية مختلفة من الأنسجة العضلية الهيكلية للفئران لقياس ومقارنة مستويات النترات والنتريت. علاوة على ذلك ، نقارن أوزان العينات المختلفة للتحقق مما إذا كان حجم عينة الأنسجة يؤثر على نتائج التجانس.
Abstract
كان يعتقد في السابق أن أيونات النترات (NO3–) هي منتجات نهائية خاملة لعملية التمثيل الغذائي لأكسيد النيتريك (NO). ومع ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن تحويل أيونات النترات مرة أخرى إلى NO في الثدييات من خلال آلية اختزال من خطوتين: يتم تقليل النترات إلى النتريت (NO2–) في الغالب عن طريق البكتيريا المتعايشة عن طريق الفم ، ثم يتم تقليل النتريت إلى NO بواسطة عدة آليات بما في ذلك عن طريق البروتينات المحتوية على الهيم أو الموليبدينوم. يساهم مسار النترات الاختزالي هذا في تعزيز مسارات الإشارات بدون وساطة ، لا سيما في نظام القلب والأوعية الدموية وأثناء ممارسة العضلات. يتم تحديد مستويات النترات في الجسم قبل هذا الاستخدام من خلال مصدرين مختلفين: عدم الأكسدة الذاتية وتناول النترات الغذائية ، بشكل أساسي من النباتات. لتوضيح دورة NO المعقدة في الظروف الفسيولوجية ، قمنا بفحص ديناميكيات مستقلباتها وأيونات النترات والنتريت ، والتي تكون مستقرة نسبيا مقارنة ب NO. في الدراسات السابقة ، تم تحديد العضلات الهيكلية كعضو تخزين رئيسي لأيونات النترات في الثدييات ، وكذلك مصدر مباشر ل NO أثناء التمرين. لذلك ، فإن إنشاء منهجية موثوقة لقياس مستويات النترات والنتريت في العضلات الهيكلية أمر مهم ويجب أن يكون مفيدا في توسيع نطاق تطبيقه ليشمل عينات الأنسجة الأخرى. يشرح هذا البحث بالتفصيل إعداد عينات العضلات الهيكلية ، باستخدام ثلاث طرق تجانس مختلفة ، لقياسات النترات والنتريت ويناقش القضايا المهمة المتعلقة بعمليات التجانس ، بما في ذلك حجم العينات. كما تمت مقارنة تركيزات النيترات والنتريت عبر أربع مجموعات عضلية مختلفة.
Introduction
يلعب أكسيد النيتريك (NO) ، وهو جزيء إشارات غازي صغير ، دورا مهما في العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية1. لا يمكن إنتاج NO من L-arginine بواسطة إنزيمات داخلية من عائلة سينسيز أكسيد النيتريك (NOS) قبل الخضوع للأكسدة السريعة للنترات (NO 3-) ، وربما النتريت (NO 2–) في الدم والأنسجة 2,3. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن هذه الأنيونات قد تم اختزالها مرة أخرى إلى NO في أنظمة الثدييات4. يتم تحويل النترات إلى نتريت ، بشكل رئيسي عن طريق اختزال النترات البكتيرية المتعايشة في تجويف الفم التي تعمل على الأيونات التي تفرزها الغدد اللعابية وتبتلع مباشرة 5 ، وإلى حد ما ، عن طريق إنزيمات الثدييات مثل أوكسيدوريكتاز الزانثين 6,7. يمكن تقليل النتريت إلى NO من خلال عدة آليات بما في ذلك deoxyhemoglobin8 ، deoxymyoglobin9 ، الإنزيمات المحتوية على الموليبدينوم 10 ، والاختزال غير الأنزيمي في وجود البروتونات11,12.
يتم تعزيز مسار النترات – النتريت – NO في ظل ظروف نقص الأكسجين حيث يتضاءل نشاط NOS لأن NOS يتطلب الأكسجين لتوليدNO 4. أبلغت العديد من الدراسات الحديثة عن آثار مفيدة للنترات الغذائية على تنظيم ضغط الدم وأداء التمارين الرياضية ، مما يشير إلى أن مسارات تقليل النترات تساهم في زيادة إشارات NO13،14،15. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن بعض العضلات الهيكلية هي على الأرجح أماكن تخزين النترات الرئيسية في الجسم16. بالمقارنة مع الدم أو الأعضاء الداخلية الأخرى مثل الكبد ، تحتوي العضلات الهيكلية (gluteus maximus) على مستويات أعلى بكثير من النترات ولها كتلة كبيرة في جسم الثدييات. تبين أن تمرين جهاز المشي يعزز تقليل النترات إلى النتريت و NO في الألوية في نموذجالفئران 7. تشير هذه النتائج إلى أن بعض العضلات الهيكلية يمكن أن تكون مصادر مهمة ل NO من خلال مسارات تقليل النترات في المواقف الفسيولوجية. تشير الدراسات الحديثة إلى أن هذه النتائج ، بما في ذلك التغيرات في مستويات نترات العضلات أثناء التمرين ، تحدث أيضا في البشر17.
كان اثنان من المؤلفين الحاليين قد وضعا سابقا طريقة لقياس مستويات النترات والنتريت في الدم وعينات سائلة أخرى18. ومع ذلك ، عندما تم تحليل مستويات هذه الأنيونات في تجانس الأنسجة في البداية ، لم تكن البروتوكولات التفصيلية متاحة. لفهم ديناميكيات النترات – النتريت – NO في العديد من الأعضاء المختلفة ، كان هدفنا هو تطوير طريقة دقيقة وفعالة لقياس مستويات النترات والنتريت في أنسجة الثدييات بما في ذلك العضلات الهيكلية. في الدراسات السابقة ، تم استخدام أنسجة القوارض لتطوير عمليات تجانس موثوقة ثم تحليل محتويات النترات والنتريت في تلك التجانسات7،16،19. تم توسيع استخدام طريقة التجانس هذه لتشمل عينات خزعة العضلات الهيكلية البشرية ، حيث تم تأكيد القيم ، والأهم من ذلك ، كانت القيم التي لوحظت للعضلات مقارنة بالدم / البلازما في نطاقات ونسب مماثلة لتلك التي لوحظت في القوارض17. في السنوات الأخيرة ، بدأت مجموعات أخرى أيضا في قياس مستويات النترات والنتريت في تجانس العضلات الهيكلية ، وأبلغت عن قيم قابلة للمقارنة لتلك التي أبلغت عنها مجموعتنا20,21.
الهدف من ورقة البروتوكول هذه هو وصف تفصيلي لإعداد متجانسات العضلات الهيكلية باستخدام ثلاث طرق تجانس مختلفة للقياس اللاحق لمستويات النترات والنتريت. بالإضافة إلى ذلك ، تم فحص تأثيرات وزن الأنسجة المستخدمة للتجانس على قيم النترات والنتريت في عينات العضلات الهيكلية. نعتقد أن هذه الطرق يمكن تطبيقها بسهولة على أنواع أخرى من أنسجة الثدييات. في الآونة الأخيرة ، وخاصة في مجال فسيولوجيا التمرين ، تم إيلاء الاهتمام للاختلافات المحتملة في فسيولوجيا النترات / النتريت / NO وفقا لمجموعات العضلات. نبلغ أيضا عن كميات النترات والنتريت في أربع عضلات مختلفة للقوارض ونجد توزيعا غير منتظم لكلا الأيونات بين هذه العضلات المختلفة. ملاحظة تتطلب مزيدا من الدراسة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لمراقبة التغيرات في مستقلبات NO والنترات والنتريت ، كدالة للتدخلات الفسيولوجية ، من الضروري قياس مستويات هذه الأيونات في الأعضاء المختلفة التي تعتبر حاسمة في عملية التمثيل الغذائي. نظرا لأن الهيموجلوبين في الدم سوف يتفاعل مع NO ومستقلباته ، فمن المهم أيضا إزالة الدم بسرعة من عينات الأنسجة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH / NIDDK الداخلية ZIA DK 0251041-14 إلى Alan N Schechter ، MD.
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al. Stomach NO synthesis. Nature. 368 (6471), 502 (1994).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
