Beredning av råttors skelettmuskelhomogenater för nitrat- och nitritmätningar

Summary

Vi presenterar protokoll för tre olika metoder för homogenisering av fyra olika muskelgrupper i råttskelettmuskelvävnad för att mäta och jämföra nivåerna av nitrat och nitrit. Vidare jämför vi olika provvikter för att undersöka om vävnadsprovets storlek påverkar resultaten av homogenisering.

Abstract

Nitratjoner (^NO3-) ansågs en gång vara inerta slutprodukter av kväveoxidmetabolism (NO). Tidigare studier visade dock att nitratjoner kan omvandlas tillbaka till NO hos däggdjur genom en tvåstegsreduktionsmekanism: nitrat reduceras till nitrit (^NO2-) mestadels av orala kommensala bakterier, sedan reduceras nitrit till NO genom flera mekanismer inklusive via hem- eller molybdeninnehållande proteiner. Denna reduktiva nitratväg bidrar till att förbättra NO-medierade signalvägar, särskilt i hjärt-kärlsystemet och under muskelträning. Nitrathalterna i kroppen före sådan användning bestäms av två olika källor: endogen NO-oxidation och nitratintag via kosten, huvudsakligen från växter. För att belysa den komplexa NO-cykeln under fysiologiska omständigheter har vi undersökt vidare dynamiken i dess metaboliter, nitrat- och nitritjoner, som är relativt stabila jämfört med NO. I tidigare studier identifierades skelettmuskulaturen som ett viktigt lagringsorgan för nitratjoner hos däggdjur, samt en direkt källa till NO under träning. Därför är det viktigt att fastställa en tillförlitlig metod för att mäta nitrat- och nitritnivåer i skelettmuskulaturen och bör vara till hjälp för att utvidga dess tillämpning till andra vävnadsprover. Detta dokument förklarar i detalj beredningen av skelettmuskelprover, med hjälp av tre olika homogeniseringsmetoder, för nitrat- och nitritmätningar och diskuterar viktiga frågor relaterade till homogeniseringsprocesser, inklusive provernas storlek. Nitrat- och nitritkoncentrationer har också jämförts mellan fyra olika muskelgrupper.

Introduction

Kväveoxid (NO), en liten gasformig signalmolekyl, spelar en avgörande roll i fysiologiska och patofysiologiska processer¹. NO kan framställas från L-arginin av endogena enzymer i familjen kväveoxidsyntas (NOS) innan de genomgår snabb oxidation till nitrat (^NO3-) och eventuellt nitrit (^NO2-) i blod och vävnader ^2,3. Nyligen har dessa anjoner visat sig reduceras tillbaka till NO i däggdjurssystem⁴. Nitrat omvandlas till nitrit, huvudsakligen genom kommensala bakteriella nitratreduktaser i munhålan som verkar på joner som utsöndras av spottkörtlarna och direkt intas ⁵, och till viss del av däggdjursenzymer såsom xantinoxidoreduktas ^6,7. Nitrit kan ytterligare reduceras till NO genom flera mekanismer inklusive deoxihemoglobin⁸, deoxymyoglobin⁹, molybdeninnehållande enzymer 10 och icke-enzymatisk reduktion i närvaro av protoner^11,12.

Denna nitrat-nitrit-NO-väg förbättras under hypoxiska förhållanden där NOS-aktiviteten minskar eftersom NOS kräver syre för NO-generation⁴. Många nyligen genomförda studier har rapporterat positiva effekter av dietnitrat på blodtrycksreglering och träningsprestanda, vilket tyder på att nitratreduktionsvägar bidrar till ökningen av NO-signalering^13,14,15. Tidigare studier har visat att vissa skelettmuskler sannolikt är de stora nitratlagringsplatserna i kroppen¹⁶. Jämfört med blod eller andra inre organ som lever innehåller skelettmuskulaturen (gluteus maximus) signifikant högre nitratnivåer och har en betydande massa i däggdjurskroppen. Löpbandsträning visade sig öka nitratreduktionen till nitrit och till NO i gluteus i en råtta modell⁷. Dessa resultat antyder att vissa skelettmuskler kan vara viktiga källor för NO genom nitratreduktionsvägar i fysiologiska situationer. Nyare studier tyder på att dessa fynd, inklusive förändringar i muskelnitratnivåer under träning, också förekommer hos människor¹⁷.

Två av de nuvarande författarna hade tidigare etablerat en metod för att mäta nitrat- och nitritnivåer i blod och andra vätskeprover¹⁸. Men när nivåerna av dessa anjoner i vävnadshomogenater initialt analyserades var detaljerade protokoll inte tillgängliga. För att förstå nitrat-nitrit-NO-dynamiken i flera olika organ var vårt mål att utveckla en exakt och effektiv metod för att mäta nitrat- och nitritnivåer i däggdjursvävnader inklusive skelettmuskulatur. I tidigare studier användes gnagarvävnader för att utveckla tillförlitliga homogeniseringsprocesser och sedan analysera nitrat- och nitritinnehåll i dessa homogenater 7,16,19. Användningen av denna homogeniseringsmetod utvidgades till humana skelettmuskelbiopsiprover, varigenom värdena bekräftades, och viktigare, de värden som observerades för muskler jämfört med blod / plasma var i liknande intervall och förhållanden som de som observerades hos gnagare¹⁷. Under de senaste åren har andra grupper också börjat mäta nitrat- och nitritnivåer i skelettmuskelhomogenater och rapporterat jämförbara värden med de som rapporterats av vår grupp^20,21.

Syftet med detta protokollpapper är att i detalj beskriva beredningen av skelettmuskelhomogenater med hjälp av tre olika homogeniseringsmetoder för efterföljande mätning av nitrat- och nitritnivåer. Dessutom undersöktes effekterna av vävnadsvikt som används för homogenisering på värden av nitrat och nitrit i skelettmuskelprover. Vi tror att dessa metoder lätt kan tillämpas på andra typer av däggdjursvävnader. På senare tid, särskilt inom träningsfysiologi, hade man uppmärksammat de möjliga skillnaderna i nitrat/nitrit/NO-fysiologi beroende på muskelgrupper. Vi rapporterar också mängderna nitrat och nitrit i fyra olika gnagarmuskler och hittar en icke-enhetlig fördelning av båda jonerna mellan dessa olika muskler; en observation som kräver ytterligare studier.

Protocol

Djurprotokollet godkändes av NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Djur hanterades och behandlades enligt den aktuella guiden för vård och användning av försöksdjur som finns fritt tillgänglig på AAALAC:s webbplats. 1. Råtta skelettmuskeluppsamling Medan en råtta är under djupbedövning (5% isofluran, bekräftad av frånvarande reaktion på svans / bennypa), starta perfusion med saltlösning innehållande heparin genom att placera en 19 G nål i en topp i …

Representative Results

För att få representativa resultat användes skelettmuskelvävnader från 8 Wistar-råttor (män och kvinnor, vikt 250 ± 50 g). Råttors skelettmuskelhomogenater (50 mg gluteus maximus-muskel för varje metod) framställdes av tre olika homogeniseringsverktyg (roterande homogenisator, pärlhomogenisator och pulveriserare). Nitrat- och nitrithalten i dessa homogenater bestämdes sedan med användning av en kväveoxidanalysator (NOA) (figur 4). Nitrathalterna (figur 4A<…

Discussion

För att övervaka förändringar i NO-metaboliterna, nitrat och nitrit, som en funktion av fysiologiska ingrepp, är det absolut nödvändigt att mäta nivåerna av dessa joner i de olika organen som är kritiska i deras ämnesomsättning. Eftersom hemoglobin i blod kommer att reagera med NO och dess metaboliter är det också viktigt att snabbt ta bort blod från vävnadsprover så mycket som möjligt. Således perfuserades djur med saltlösning innan de samlade skelettmuskelvävnader (gluteus, TA, EDL, gastrocnemiusmu…

Materials

gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit