यहां, हम एक मार्कर के रूप में फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके पुरुष एडीज एजिप्टी की संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मादा मच्छरों को मैथुन के लिए चिह्नित और अचिह्नित दोनों पुरुषों के संपर्क में आता है। संभोग के बाद, उनके शुक्राणुओं की जांच फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत की जाती है ताकि उनके संभोग साथी का निर्धारण किया जा सके।
बाँझ या असंगत कीट तकनीक आधारित जनसंख्या दमन कार्यक्रमों की सफलता जारी पुरुषों की क्षमता पर निर्भर करता है जंगली प्रकार की महिलाओं के लिए प्रतिस्पर्धा करने और लक्ष्य आबादी में बांझपन प्रेरित । इसलिए, क्षेत्र रिलीज से पहले रिलीज तनाव की फिटनेस का मूल्यांकन करने के लिए पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा का प्रयोगशाला मूल्यांकन आवश्यक है। परंपरागत रूप से, इस तरह की परख मादाओं द्वारा उत्पादित व्यवहार्य अंडों के अनुपात का निर्धारण करके किया जाता है, जो एक साथ पुरुषों के दो सेट (जंगली-प्रकार और रिलीज उपभेदों) के संपर्क में मैथुन के लिए होता है। हालांकि, यह प्रक्रिया अंडे के उत्पादन के लिए महिलाओं को पहले रक्त-फ़ीड करने की आवश्यकता के कारण समय लेने वाली और श्रमसाध्य है और फिर अंडे की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए रची अंडे को हैच और गणना करती है।
इसके अलावा, यह विधि दो बाँझ या वुबाचिया-संक्रमितमच्छर लाइनों के बीच प्रतिस्पर्धा की डिग्री को नहीं समझ सकती है क्योंकि जंगली प्रकार की मादा मच्छर केवल दोनों के साथ संभोग पर गैर-व्यवहार्य अंडे का उत्पादन करेंगे। इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, यह पेपर फ्लोरोसेंट डाई, रोडामाइन बी (आरएचबी) का उपयोग करके प्रयोगशाला सेटिंग्स में पुरुष मच्छर संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता को मापने की अधिक प्रत्यक्ष विधि का वर्णन करता है, जिसका उपयोग आरएचबी युक्त सुक्रोज समाधान में खिलाकर पुरुषों को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। संभोग परख के बाद, मादा के शुक्राणुओं में फ्लोरेस्किंग शुक्राणुओं की उपस्थिति का उपयोग उसके संभोग साथी को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह विधि लागत प्रभावी है, प्रायोगिक समय को 90% तक कम कर देती है और दो बाँझ या वुबाचिया-संक्रमित लाइनों के बीच संभोग फिटनेस की तुलना की अनुमति देती है।
एडीज मच्छरों की आबादी के दमन के लिए बाँझ या असंगत पुरुषों के पालन और रिहाई वर्तमान में डेंगू और अन्य एडीजजनित रोग के प्रकोप को रोकने के लिए एक उपन्यास उपकरण के रूप में क्षेत्र में मूल्यांकन किया जा रहा है1। वर्तमान में क्षेत्र परीक्षणों में पुरुष-रिलीज दमन रणनीतियों में आनुवंशिक विधि2,विकिरण (बाँझ कीट तकनीक, एसआईटी)3,एंडोसिमियोटिक बैक्टीरिया वुलबाचिया (कीट असंगत तकनीक, आईआईटी)4,या बाद की दो तकनीकों का संयोजन5,6का उपयोग शामिल है। इन दृष्टिकोणों की सफलता काफी हद तक जारी किए गए पुरुषों की जंगली प्रकार के पुरुषों को मात देने और मैथुन सुरक्षित करने के लिए महिलाओं की तलाश करने की क्षमता पर निर्भर करती है। अन्यथा, लक्षित जनसंख्या में बंध्यता को प्रेरित नहीं किया जा सकता है।
उदाहरण के लिए, एक शास्त्रीय एसआईटी कार्यक्रम में, पुरुष संभोग फिटनेस विकिरण खुराक7, 8, 9,बड़े पैमाने पर पालन प्रोटोकॉल और कॉलोनी10, 11,12,13,14 जैसे कारकों से प्रभावित हो सकता है। इसके अलावा, संभोग प्रतिस्पर्धा पर अध्ययन मच्छर संभोग व्यवहार पर महत्वपूर्ण ज्ञान प्रदान कर सकते हैं जिसका उपयोग वेक्टर नियंत्रण रणनीतियों को सूचित करने के लिए किया जा सकता है।
एसआईटी और आईआईटी में, पुरुष मच्छरों की संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता का आकलन आम तौर पर जंगली प्रकार दोनों की अनुमति देकरऔर एक पिंजरे8,11, 15, 16में जंगली प्रकार की महिलाओं के लिए प्रतिस्पर्धा करने के लिए तनाव जारी करकेकिया जाताहै। महिलाओं को तब रक्त-खिलाया जाता है और उनके अंडे व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए रची जाती हैं। महिलाओं कि कम हैच दर के साथ गैर व्यवहार्य अंडे या अंडे रखना रिलीज तनाव पुरुषों के साथ संभोग किया है माना जाता है, जबकि महिलाओं कि व्यवहार्य अंडे का उत्पादन जंगली प्रकार के पुरुषों के साथ संभोग किया है माना जाता है । इसके बाद तला हुआ सूचकांक17के साथ संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता की गणना की जाती है । दुर्भाग्य से, यह विधि संसाधन-प्रधान और समय लेने वाली है, और समग्र फ्राइड इंडेक्स को बाहरी भ्रामक कारकों से प्रभावित किया जा सकता है जैसे कि खराब अंडे से निपटने और अधिक-desiccation के परिणामस्वरूप अनुकूलता क्रॉस में कम हैच दर हो सकती है जो तब कृत्रिम रूप से कम फ्राइड इंडेक्स का कारण बन सकती है।
इसके अलावा, यह विधि एडीज मच्छरों के बीच संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता की सीधी तुलना के लिए अनुमति नहीं देती है जो वुबाचिया के विभिन्न उपभेदों से संक्रमित हैं या जो विकिरण की विभिन्न खुराकों के संपर्क में हैं। इसलिए, इन चुनौतियों से निपटने के लिए एक और प्रत्यक्ष विधि की आवश्यकता है । हाल के अध्ययनोंमें 18,19 ने नर मच्छरों के मौलिक तरल पदार्थ को चिह्नित करने के लिए फ्लोरोसेंट डाई, आरएचबी का उपयोग करने की प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया है। चिह्नित मौलिक तरल पदार्थ को सफल संभोग पर मादा मच्छरों के शुक्राणुओं में स्थानांतरित और संग्रहित किया जाता है, जिससे चिह्नित पुरुषों के साथ मादा संभोग बातचीत की प्रत्यक्ष माप की अनुमति होती है। रोडामाइन बी एक थिओल-प्रतिक्रियाशील फ्लोरोन डाई है जो आमतौर पर कीड़े 20 सहित जानवरों में पारिस्थितिक और व्यवहार अनुसंधान अध्ययन के लिए बायोमार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है। मच्छरों के अध्ययन के लिए, आरएचबी को चीनी या शहद के पानी के साथ भोजन करके पेश किया जाता है जिसमें घुलित आरएचबी पाउडर18,19,21,22,23, 24होता है। तेज होने पर, आरएचबी डाई प्रोटीन के लिए बांधता है, एक लाल-गुलाबी दाग के साथ शरीर के ऊतकों को धुंधला करता है जो फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत के तहत उज्ज्वल नारंगी को फ्लोरेस्स्क करता है।
मार्किंग के मजबूत फ्लोरेसेंस सिग्नल और स्थिरता, कीट मौलिक तरल पदार्थों को दागने की क्षमता के साथ, लेबल किए गए पुरुष से मादा कीट के शुक्राणु भंडारण अंगों को चिह्नित मौलिक तरल पदार्थ के हस्तांतरण की निगरानी के लिए अनुमति देताहै। एक पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा परख में RhB का उपयोग न केवल चिह्नित और अचिह्नित पुरुषों के साथ महिलाओं के संभोग बातचीत के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है, लेकिन परिणाम भी 24 घंटे के भीतर प्राप्त किया जा सकता है के रूप में यह अंडा व्यवहार्यता है, जो आम तौर पर लगभग 10 से 14 दिनों की आवश्यकता का निर्धारण करने की प्रक्रिया को obviates । इसके अलावा, यह विधि डेटा के संभावित नुकसान पर काबू पा जाती है जब मादा मच्छर रक्त-फ़ीड नहीं करते हैं या अंडाशय से पहले मर जाते हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि अर्ध-क्षेत्र परीक्षणों में, जहां मादा मच्छरों को बैग या यांत्रिक एस्पिरेटर का उपयोग करके पोस्ट-संभोग संग्रह के दौरान नुकसान और मौत का खतरा होता है। मादा प्रजनन क्षमता का उपयोग करने की वर्तमान सीमाओं को संबोधित करने के लिए हम एक वैकल्पिक विधि पेश करते हैं जो सीधे पुरुष मच्छर संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता को मापने के लिए आरएचबी धुंधला का उपयोग करता है। विधि कार्यप्रवाह को सरल बनाता है, प्रयोगात्मक समय को लगभग दो सप्ताह से एक दिन तक छोटा कर देता है, जिससे अधिक प्रयोगात्मक प्रतिकृति को बाहर किया जा सकता है और दो रिलीज उपभेदों के बीच तुलना की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल उन प्रयोगशालाओं के लिए उपयुक्त होगा जो पुरुष रिलीज-आधारित मच्छर जनसंख्या दमन कार्यक्रमों पर तैयार कर रहे हैं, और नियमित गुणवत्ता नियंत्रण और तनाव मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जा सकता है।
मार्किंग आमतौर पर कीट जनसंख्या गतिशीलता, फैलाव, व्यवहार, और संभोग जीव विज्ञान26का अध्ययन करने के लिए कीट विज्ञान अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है । एसआईटी और आईआईटी कार्यक्रमों में, क्षेत्र की आबादी से रिहाई तनाव को अलग करने के लिए उनके फैलाव का अध्ययन करने और रिलीज अनुपात को अनुकूलित करने के लिए अंकन किया जाता है । उपयोग की जाने वाली अंकन विधियों में आनुवांशिक अंकन27,28 , लार्वा भोजन29,30, फ्लोरोसेंट डस्ट31और डाई32में आइसोटोप शामिल हैं . एसआईटी या आईआईटी का उपयोग करके मच्छरों की आबादी के दमन के लिए, जहां पुरुष संभोग फिटनेस एक महत्वपूर्ण घटक है, फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग मच्छर संभोग जीव विज्ञान18,19का अध्ययन करने के लिए मार्कर के रूप में किया गया है।
परंपरागत रूप से, रिहाई तनाव के पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा का आकलन महिला प्रजनन परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया है । हालांकि, यह परख समय लेने वाली और श्रम-प्रधान है क्योंकि डाउनस्ट्रीम प्रायोगिक प्रक्रियाओं के बाद संभोग(पूरक चित्रा S1)। इन प्रक्रियाओं में मादाओं का रक्त-भोजन, अंडा संग्रह, अंडे का हैचिंग, और अंडे की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए रची अंडे के अनुपात की गणना शामिल है। औसतन, इस परख के लिए 30 मानव घंटे और दो सप्ताह के प्रायोगिक कार्य (प्रतिस्पर्धात्मकता परख पिंजरों की स्थापना से शुरू) पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा के अंतिम निर्धारण के लिए आवश्यक है ।
उनका पेपर महिलाओं और आरएचबी-चिह्नित पुरुषों के बीच संभोग बातचीत को सीधे मापने के लिए मच्छरों, पूरक चित्रा S2को सीधे मापने के लिए फ्लोरोसेंट डाई, आरएचबी, (मच्छरों को 0.2% आरएचबी-सुक्रोज के रूप में खिलाया गया) का उपयोग प्रस्तुत करता है। हालांकि इस प्रोटोकॉल में फ्लोरेसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है, यह ऊपर उल्लिखित समय लेने वाली प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को करने की आवश्यकता को कम करता है। औसतन, इस RhB आधारित परख लगभग 10 आदमी घंटे की आवश्यकता है और एक दिन के बारे में महिला प्रजनन परख से है कि बराबर डेटा प्राप्त करने के लिए । यह >90% समय बचत शोधकर्ताओं को कई प्रयोगात्मक प्रतिकृति प्रदर्शन करने की अनुमति देता है, पुरुष संभोग फिटनेस का अधिक मजबूत सत्यापन प्रदान करता है। इसके अलावा, इस परख का उपयोग दो बाँझ या वुलबाचिया संक्रमित मच्छरों की रेखाओं के बीच संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता की तुलना करने के लिए किया जा सकता है।
पारंपरिक महिला प्रजनन परख के साथ इस प्रकार की तुलना संभव नहीं है, क्योंकि महिलाएं ऐसी दोनों पंक्तियों के साथ संभोग पर गैर-व्यवहार्य अंडे प्राप्त करेंगी। बावजूद, प्रयोग में किसी भी मिश्रित संभोग के परिणामस्वरूप चिह्नित आबादी की ओर पूर्वाग्रह होगा क्योंकि महिला शुक्राणुओं में अचिह्नित शुक्राणुओं की पहचान करना मुश्किल है जिसमें आरएचबी-चिह्नित और अचिह्नित दोनों पुरुषों से मौलिक तरल पदार्थ होते हैं । इसी तरह का निष्कर्ष आरएचबी18का उपयोग करके एनोफेल्स गैम्बिया की संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता का आकलन करने वाले अध्ययन में किया गया था, जिसके तहत संभोग परख में महिलाओं का एक बड़ा हिस्सा चिह्नित पुरुषों द्वारा मिलाया गया था । चूंकि पॉलीएंड्री उन महिलाओं में होने की अधिक संभावना है जो पहले बाधित संभोग33में लगी थीं, इस अध्ययन में इन प्रयोगों में एक बड़े पिंजरे की मात्रा (0.216 मीटर3)में कम मच्छरों (20 पुरुषों से 10 महिलाओं) का उपयोग करके इस अध्ययन में कम किया गया था।
परिणाम RhB के प्रति कोई पूर्वाग्रह-चिह्नित जनसंख्या दिखाया, यह दर्शाता है कि मिश्रित संभोग सीमित था । संक्षेप में, एक संभोग प्रतिस्पर्धा परख में पुरुषों को चिह्नित करने के लिए RhB का समावेश पुरुष संभोग फिटनेस का मूल्यांकन करने का एक किफायती और तेजी से तरीका है । यह विधि विकिरण की विभिन्न खुराकों के संपर्क में आने वाले पुरुषों के बीच संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता की सीधी तुलना के लिए भी अनुमति देती है, जो विभिन्न पालन व्यवस्थाओं में पाला जाता है, या वुबाचियाके विभिन्न उपभेदों से संक्रमित लोग, यह किसी भी पुरुष रिहाई-आधारित मच्छर जनसंख्या दमन कार्यक्रम के लिए पुरुष संभोग फिटनेस के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाता है।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को राष्ट्रीय पर्यावरण एजेंसी (एनईए), सिंगापुर द्वारा वित्त पोषित किया गया था । हम श्री चबाना मिंग एफएआई, उप मुख्य कार्यकारी अधिकारी (सार्वजनिक स्वास्थ्य), एनईए, अध्ययन प्रकाशित करने के लिए अपने अनुमोदन के लिए धन्यवाद, और एक/प्रो एनजी ली चिंग, समूह निदेशक (पर्यावरण स्वास्थ्य संस्थान समूह), एनईए, इस अध्ययन में उसके समर्थन के लिए । हम पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग के लिए डॉ शुज़ेन सिम और डॉ डेनिस टैन को भी धन्यवाद देते हैं ।
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
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Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |