Здесь мы представляем протокол изучения конкурентоспособности спаривания самцов Aedes aegypti с использованием флуоресцентного красителя в качестве маркера. Самки комаров подвергаются воздействию как маркированных, так и немаркированных самцов для совокупления. После спаривания их сперматеки исследуются под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить их партнера по спариванию.
Успех программ подавления популяций, основанных на методах стерильных или несовместимых насекомых, зависит от способности выпущенных самцов конкурировать за самок дикого типа и вызывать бесплодие в целевой популяции. Следовательно, лабораторная оценка конкурентоспособности самцов в спаривании имеет важное значение для оценки пригодности штамма высвобождения до выхода в поле. Обычно такой анализ выполняется путем определения доли жизнеспособных яиц, произведенных самками после одновременного воздействия двух наборов самцов (штаммов дикого типа и высвобождения) для совокупления. Однако этот процесс является трудоемким и трудоемким из-за необходимости сначала кормить кровью самок для производства яиц, а затем высиживать и перечислять вылупившиеся яйца для определения жизнеспособности яиц.
Кроме того, этот метод не может определить степень конкурентоспособности между двумя стерильными или зараженными Wolbachiaлиниями комаров, поскольку самки комаров дикого типа будут производить нежидкие яйца только при спаривании с обоими. Чтобы обойти эти ограничения, в этой статье описывается более прямой метод измерения конкурентоспособности спаривания самцов комаров в лабораторных условиях с использованием флуоресцентного красителя родамин B (RhB), который можно использовать для маркировки самцов путем кормления их раствором сахарозы, содержащим RhB. После брачного анализа наличие флуоресцентных сперматозоидов в сперматеках самки может быть использовано для определения ее партнера по спаривательству. Этот метод является экономически эффективным, сокращает время эксперимента на 90% и позволяет сравнивать брачную пригодность между двумя стерильными или Wolbachia-инфицированнымилиниями.
Выращивание и выпуск стерильных или несовместимых самцов для подавления популяций комаров Aedes в настоящее время оценивается в полевых условиях в качестве нового инструмента для предотвращения вспышек лихорадки денге и других заболеваний, переносимых Aedes1. Стратегии подавления высвобождения мужчин, которые в настоящее время находятся в полевых испытаниях, включают использование генетического метода2,облучение (Sterile Insect Technique, SIT)3,эндосимбиотических бактерий Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4или комбинацию последних двух методов5,6. Успех этих подходов во многом зависит от способности освобожденных самцов превзойти самцов дикого типа и искать самок для обеспечения совокупления. В противном случае бесплодие не может быть вызвано в целевой популяции.
В классической программе SIT, например, на брачную пригодность самцов могут влиять такиефакторы,как доза облучения7,8,9,протокол массового выращивания и степень инбридинга в колонии10,11,12,13,14. Кроме того, исследования конкурентоспособности спаривания могут дать важные знания о брачном поведении комаров, которые могут быть использованы для информирования о стратегиях борьбы с переносчиками.
В SIT и IIT конкурентоспособность самцов комаров обычно оценивается, позволяя как диким, так и высвобождающим штаммам конкурировать за самок дикого типа в клетке8,11,15,16. Затем самок кормят кровью, а их яйца вылупляются для определения жизнеспособности. Предполагается, что самки, которые откладывают нежизрелые яйца или яйца с низкой скоростью вылупления, спаривались с самцами штамма высвобождения, в то время как самки, которые производят жизнеспособные яйца, предположительно спаривались с самцами дикого типа. Затем конкурентоспособность спаривания рассчитывается с помощью индекса Жары17. К сожалению, этот метод является ресурсоемким и трудоемким, и на общий индекс Жары может влиять внешние смешанные факторы, влияющие на жизнеспособность яиц, такие как плохая обработка яиц и чрезмерное высыхание, что может привести к низкой скорости вылупления в кроссе совместимости, что может привести к искусственно заниженному индексу Жареного.
Кроме того, этот метод не позволяет проводить прямое сравнение конкурентоспособности спаривания между комарами Aedes, которые заражены различными штаммами Wolbachia или подвергаются различным дозам облучения. Следовательно, для решения этих проблем требуется более прямой метод. Недавние исследования18,19 продемонстрировали эффективность использования флуоресцентного красителя RhB для маркировки семенной жидкости самцов комаров. Маркированная семенная жидкость переносится и хранится в сперматеках самок комаров после успешного спаривания, что позволяет напрямую измерять брачное взаимодействие самок с отмеченными самцами. Родамин B является тиол-реактивным фтороновым красителем, обычно используемым в качестве биомаркера для экологических и поведенческих исследований на животных, включая насекомых20. Для исследований комаров RhB вводят путем кормления сахаром или медовой водой, содержащей растворенный порошок RhB18,19,21,22,23,24. При поглощении rhB-краситель связывается с белками, окрашивая ткани тела красновато-розовым пятном, которое флуоресцирует ярко-оранжевым под флуоресцентным источником света.
Сильный флуоресцентный сигнал и стабильность маркировки в сочетании с ее способностью окрашивать семенные жидкости насекомых позволяют осуществлять мониторинг переноса выраженной семенной жидкости от меченого самца к органам хранения спермы самки насекомого для брачных исследований18,19,21,24. Использование RhB в анализе конкурентоспособности спаривания самцов не только позволяет напрямую измерить брачное взаимодействие самок с отмеченными и немаркированными самцами, но результаты также могут быть получены в течение 24 ч, поскольку это устраняет процесс определения жизнеспособности яйца, который обычно занимает от 10 до 14 дней. Кроме того, этот метод преодолевает потенциальную потерю данных, когда самки комаров не питаются кровью или умирают до яйцекладки. Это особенно важно, потому что в полуполовых испытаниях, где самки комаров склонны к повреждениям и смерти во время сбора после спаривания с использованием рюкзака или механического аспиратора. Чтобы устранить существующие ограничения использования женской фертильности, мы представляем альтернативный метод, который использует окрашивание RhB для непосредственного измерения конкурентоспособности спаривания самцов комаров. Метод упрощает рабочий процесс, сокращает время эксперимента примерно с двух недель до одного дня, что позволяет проводить больше экспериментальных реплик и позволяет сравнивать два штамма высвобождения. Этот протокол будет подходить для лабораторий, которые приступают к программам подавления популяции комаров на основе высвобождения самцов, и может использоваться для рутинного контроля качества и оценки штаммов.
Маркировка обычно используется в энтомологических исследованиях для изучения динамики популяции насекомых, рассеивания, поведения и биологии спаривания26. В программах SIT и IIT маркировка проводится для дифференциации штамма высвобождения от полевой популяции для изучения их рассеивания и оптимизации коэффициента высвобождения. Используемые методы маркировки включают генетическую маркировку27,28,включающую изотопы в личиночную пищу29,30,флуоресцентную пыль31и краситель32. Для подавления популяций комаров с использованием SIT или IIT, где мужская брачная пригодность является критическим компонентом, флуоресцентные красители использовались в качестве маркеров для изучения биологии спаривания комаров18,19.
Традиционно оценка конкурентоспособности самцов по спаривательной зависимости штамма была оценена с использованием анализов на фертильность самок. Тем не менее, этот анализ является трудоемким и трудоемким из-за последующих экспериментальных процессов после спаривания(дополнительный рисунок S1). Эти процессы включают кровоспитку самок, сбор яиц, вылупление яиц и перечисление доли инкубационных яиц для определения жизнеспособности яиц. В среднем этот анализ требует 30 человеко-часов и двух недель экспериментальной работы (начиная от настройки клеток для анализа конкурентоспособности) до окончательного определения конкурентоспособности самцов.
в его статье представлено использование флуоресцентного красителя RhB (подаваемого комарам в виде 0,2% RhB-сахарозы, дополнительный рисунок S2)для непосредственного измерения брачных взаимодействий между самками и самцами с rhB-маркировкой. Хотя этот протокол требует флуоресцентного стереомикроскопа, он устраняет необходимость выполнения трудоемких экспериментальных процедур, упомянутых выше. В среднем, этот анализ на основе RhB требует примерно 10 человеко-часов и около дня для получения данных, эквивалентных данным из анализов женской фертильности. Это >90% экономии времени позволяет исследователям выполнять несколько экспериментальных реплик, обеспечивая более надежную проверку мужской брачной пригодности. Кроме того, этот анализ может быть использован для сравнения конкурентоспособности спаривания между двумя стерильными или зараженными Wolbachia линиями комаров.
Этот тип сравнения невозможен с обычными анализами плодовитости самок, так как самки будут давать нежизненные яйца при спаривании с обеими такими линиями. Несмотря на это, любое смешанное спаривание в эксперименте приведет к смещению в сторону отмеченной популяции, поскольку трудно идентифицировать немаркированные сперматозоиды в женских сперматеках, которые содержат семенную жидкость как от RhB-маркированных, так и от немаркированных самцов. Аналогичный вывод был сделан в исследовании, оценивавшем конкурентоспособность спаривания Anopheles gambiae с использованием RhB18,в результате которого было обнаружено, что большая доля самок в брачном анализе спаривалась с отмеченными самцами. Поскольку полиандрия чаще встречается у самок, которые ранее участвовали в прерванномспаривании 33,вероятность этого была снижена в этом исследовании за счет использования меньшего количества комаров (20 самцов на 10 самок) в большем объеме клетки (0,216м3)в этих экспериментах.
Результаты не показали предвзятости в сторону популяции с rhB-маркировкой, что указывает на то, что смешанное спаривание было ограничено. Таким образом, включение RhB для обозначения самцов в анализе конкурентоспособности спаривания является экономичным и быстрым способом оценки брачной пригодности самцов. Этот метод также позволяет напрямую сравнивать конкурентоспособность спаривания между самцами, подвергающимися различным дозам облучения, выращенными в разных режимах выращивания, или инфицированными различными штаммами Wolbachia,что делает его ценным инструментом для оценки брачной пригодности самцов для любой программы подавления популяции комаров на основе высвобождения самцов.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансировалось Национальным агентством по окружающей среде (NEA), Сингапур. Мы благодарим г-на Чу Мин Фая, заместителя главного исполнительного директора (общественное здравоохранение), NEA, за его одобрение опубликовать исследование, и A/Prof Ng Lee Ching, директора группы (Группа Института гигиены окружающей среды), NEA, за ее поддержку в этом исследовании. Мы также благодарим д-ра Шучжэнь Сима и д-ра Дениз Тан за корректуру рукописи.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
||
Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |