Her presenterer vi en protokoll for å studere parring av konkurranseevnen til mannlige Aedes aegypti ved hjelp av fluorescerende fargestoff som markør. Kvinnelige mygg er utsatt for både merkede og umerkede menn for kopiering. Etter parring undersøkes spermathecae under et fluorescensmikroskop for å bestemme parringspartneren.
Suksessen til sterile eller inkompatible insektteknikkbaserte befolkningsundertrykkingsprogrammer avhenger av evnen til frigjorte menn til å konkurrere om ville kvinner og indusere sterilitet i målpopulasjonen. Laboratorievurdering av mannlig parrings konkurranseevne er derfor avgjørende for å evaluere frigjøringsstammens kondisjon før feltutgivelse. Konvensjonelt utføres en slik analyse ved å bestemme andelen levedyktige egg produsert av hunnene etter å ha blitt samtidig utsatt for to sett med menn (villtype og frigjøringsstammer) for kopiering. Denne prosessen er imidlertid tidkrevende og arbeidskrevende på grunn av behovet for å først blodmate hunnene til eggproduksjon og deretter klekke og liste opp de klekkede eggene for å bestemme egg levedyktighet.
Videre kan denne metoden ikke skjelne graden av konkurranseevne mellom to sterile eller Wolbachia-infisertemygglinjer, da villtype kvinnelige mygg bare vil produsere ikke-levedyktige egg ved parring med begge deler. For å omgå disse begrensningene beskriver dette papiret en mer direkte metode for å måle mannlig myggparring konkurranseevne i laboratoriemiljøer ved hjelp av fluorescerende fargestoff, rhodamin B (RhB), som kan brukes til å markere menn ved å mate dem i sukrose løsning som inneholder RhB. Etter parringsanalysen kan tilstedeværelsen av fluorescing sperms i spermathecae av en kvinne brukes til å bestemme hennes parringspartner. Denne metoden er kostnadseffektiv, reduserer den eksperimentelle tiden med 90% og tillater sammenligning av parringstrening mellom to sterile eller Wolbachia-infisertelinjer.
Oppdrett og frigjøring av sterile eller inkompatible menn for undertrykkelse av Aedes myggpopulasjoner blir for tiden evaluert i feltet som et nytt verktøy for å forhindre utbrudd av denguefeber og annen Aedes-båretsykdom1. Mannlige frigjøringsundertrykkingsstrategier som for tiden er i feltforsøk inkluderer bruk av den genetiske metoden2, bestråling (Steril insektteknikk, SIT)3, endosymbiotiske bakterier Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4, eller en kombinasjon av de to sistnevnte teknikkene5,6. Suksessen til disse tilnærmingene er i stor grad avhengig av de frigjorte mennenes evne til å utkonkurrere ville menn og søke kvinner for å sikre kopiering. Ellers kan sterilitet ikke induserer i målpopulasjonen.
I et klassisk SIT-program kan for eksempel mannlig parring påvirkes av faktorer som bestrålingsdose7,8,9, masseoppdrettsprotokoll og omfanget av innavl i kolonien10,11,12,13,14. Videre kan studier på parrings konkurranseevne gi viktig kunnskap om mygg parring atferd som kan brukes til å informere vektorkontroll strategier.
I SIT og IIT vurderes parrings konkurranseevnen til mannlige mygg vanligvis ved å tillate både villtype og frigjøringsstamme å konkurrere om villtype kvinner i et bur8,11,15,16. Hunnene blir deretter blodmatet og eggene klekket ut for å bestemme levedyktigheten. Hunnene som legger ikke-levedyktige egg eller egg med lav lukehastighet antas å ha parret seg med frigjøringsstammehanner, mens kvinner som produserer levedyktige egg antas å ha parret seg med ville menn. Parring av konkurranseevne beregnes deretter med Fried Index17. Dessverre er denne metoden ressurskrevende og tidkrevende, og den samlede stekte indeksen kan påvirkes av eksterne forvirrende faktorer som påvirker egg levedyktighet som dårlig egghåndtering og overtørking kan resultere i en lav lukehastighet i kompatibilitetskorset som deretter kan føre til en kunstig lav stekt indeks.
Videre tillater denne metoden ikke direkte sammenligning av parring av konkurranseevne mellom Aedes mygg som er smittet med forskjellige stammer av Wolbachia eller som er utsatt for forskjellige doser bestråling. Derfor kreves en mer direkte metode for å løse disse utfordringene. Nyere studier18,19 har vist effektiviteten av å bruke fluorescerende fargestoff, RhB, for å markere mannlige myggs sædvæske. Merket sædvæske overføres og lagres i de kvinnelige myggenes spermathecae ved vellykket parring, noe som muliggjør direkte måling av kvinnelig parring interaksjon med merkede menn. Rhodamine B er et tiolreaktivt fluorfargestoff som vanligvis brukes som biomarkør for økologiske og atferdsmessige forskningsstudier hos dyr, inkludert insekter20. For myggstudier blir RhB introdusert ved fôring med sukker eller honningvann som inneholder oppløst RhB-pulver18,19,21,22,23,24. Ved opptak binder RhB-fargestoffet seg til proteiner, flekker kroppsvev med en rød-rosa flekk som fluoresces lyse oransje under en fluorescerende lyskilde.
Det sterke fluorescenssignalet og stabiliteten til merkingen, kombinert med sin evne til å flekke insekt sædvæsker, gjør det mulig å overvåke overføringen av merket sædvæske fra den merkede hannen til sædlagringsorganene til det kvinnelige insektet for parringsstudier18,19,21,24. Bruken av RhB i en mannlig parring konkurranseevneanalyse tillater ikke bare direkte måling av parring samspillet mellom kvinner med enten merkede og umerkede menn, men resultatene kan også oppnås innen 24 timer, da det hindrer prosessen med å bestemme egg levedyktigheten, som vanligvis krever ca 10 til 14 dager. Videre overvinner denne metoden det potensielle tapet av data når de kvinnelige myggene ikke blodmates eller dør før oviposisjonering. Dette er spesielt viktig fordi i semi-feltforsøk, hvor kvinnelige mygg er utsatt for skade og død under post-parring samling ved hjelp av en ryggsekk eller mekanisk aspirator. For å møte de nåværende begrensningene ved å bruke kvinnelig fruktbarhet til vi presentere en alternativ metode som bruker RhB farging for å direkte måle mannlig mygg parring konkurranseevne. Metoden forenkler arbeidsflyten, forkortet eksperimentell tid fra omtrent to uker til en dag, slik at flere eksperimentelle replikeringer kan utføres og tillater sammenligning mellom to frigjøringsstammer. Denne protokollen vil være egnet for laboratorier som tar fatt på mannlige frigjøringsbaserte myggpopulasjonsundertrykkingsprogrammer, og kan brukes til rutinemessig kvalitetskontroll og belastningsevaluering.
Merking brukes ofte i entomologisk forskning for å studere insektpopulasjonsdynamikk, spredning, oppførsel og parringsbiologi26. I SIT- og IIT-programmer utføres merking for å skille frigjøringsstammen fra feltpopulasjonen for å studere spredningen og optimalisere frigjøringsforholdet. Merkemetodene som brukes inkluderer genetisk merking27,28, inkorporering av isotoper i larvalmat29,30, fluorescerende støv31ogfargestoff 32. For undertrykkelse av myggpopulasjoner ved hjelp av SIT eller IIT, hvor mannlig parring fitness er en kritisk komponent, fluorescerende fargestoffer har blitt brukt som markører for å studere mygg parring biologi18,19.
Konvensjonelt, vurdering av mannlig parring konkurranseevne av utslipp stammen har blitt vurdert ved hjelp av kvinnelige fruktbarhet analyser. Denne analysen er imidlertid tidkrevende og arbeidskrevende på grunn av nedstrøms eksperimentelle prosesser etter parring (Supplerende figur S1). Disse prosessene inkluderer blodfôring av hunnene, eggsamling, klekking av eggene og opplisting av andelen klekkede egg for å bestemme egg levedyktighet. I gjennomsnitt krever denne analysen 30 arbeidstimer og to uker med eksperimentelt arbeid (fra å sette opp konkurranseevnens analysebur) til den endelige bestemmelsen av mannlig parring konkurranseevne.
hans papir presenterer bruken av et fluorescerende fargestoff, RhB, (matet som 0,2% RhB-sukrose til myggene, Supplemental Figure S2) for å direkte måle parringsinteraksjoner mellom kvinner og RhB-merkede menn. Selv om denne protokollen krever et fluorescenssterekroskop, hindrer den behovet for å utføre de tidkrevende eksperimentelle prosedyrene nevnt ovenfor. I gjennomsnitt krever denne RhB-baserte analysen omtrent 10 arbeidstimer og omtrent en dag for å få data som tilsvarer det fra kvinnelige fruktbarhetsanalyser. Dette >90% tidsbesparelser gjør det mulig for forskere å utføre flere eksperimentelle repliker, noe som gir en mer robust validering av mannlig parringstrening. I tillegg kan denne analysen brukes til å sammenligne parrings konkurranseevnen mellom to sterile eller Wolbachia-infiserte mygglinjer.
Denne typen sammenligning er ikke mulig med konvensjonelle kvinnelige fruktbarhetsanalyser, da kvinner ville gi ikke-levedyktige egg ved parring med begge slike linjer. Til tross for dette vil enhver blandet parring i eksperimentet resultere i skjevheter mot den markerte befolkningen, da det er vanskelig å identifisere umerkede sædceller i kvinnelig spermathecae som inneholder sædvæske fra både RhB-merkede og umerkede menn. En lignende konklusjon ble gjort i en studie som vurderte parring konkurranseevnen til Anopheles gambiae ved hjelp av RhB18, hvorved en større andel kvinner i parringsanalysen ble funnet å være parret av markerte menn. Ettersom polyandry er mer sannsynlig å forekomme hos kvinner som tidligere hadde engasjert seg i en avbrutt parring33, ble sannsynligheten for at dette skjedde redusert i denne studien ved å bruke færre mygg (20 menn til 10 kvinner) i et større burvolum (0,216 m3) i disse forsøkene.
Resultatene viste ingen skjevheter mot den RhB-merkede befolkningen, noe som indikerer at blandet parring var begrenset. Oppsummert er inkorporering av RhB for å markere menn i en parrings konkurranseanalyse en økonomisk og rask måte å evaluere mannlig parring fitness. Denne metoden tillater også direkte sammenligning av parring konkurranseevne mellom menn utsatt for forskjellige doser bestråling, oppdrettet i forskjellige oppdrettsregimer, eller de som er smittet med forskjellige stammer av Wolbachia, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for evaluering av mannlig parring egnethet for ethvert mannlig frigjøringsbasert myggpopulasjonsundertrykkingsprogram.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble finansiert av National Environment Agency (NEA), Singapore. Vi takker Mr Chew Ming Fai, viseadministrerende direktør (Public Health), NEA, for hans godkjenning for å publisere studien, og A/Prof Ng Lee Ching, group director (Environmental Health Institute Group), NEA, for hennes støtte i denne studien. Vi takker også Dr. Shuzhen Sim og Dr Denise Tan for korrekturlesing av manuskriptet.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
||
Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |