Summary
pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO細胞で発現する組換え抗体タンパク質と、従来のハイブリドーマ技術を使用して産生されたモノクローナル抗体は、ブタアミノペプチダーゼN(APN)タンパク質を認識して結合することができます。
Abstract
小腸粘膜に豊富に存在する膜結合メタロペプチダーゼであるブタアミノペプチダーゼN(APN)は、低タンパク質発現、酵素不活性、構造変化などの干渉なしに粘膜免疫応答を開始できます。これにより、APNは粘膜上皮を選択的に標的とするワクチンの開発において魅力的な候補となります。以前の研究では、APNが毒素原性 大腸 菌(大腸菌)F4と伝染性胃腸炎ウイルスの両方の受容体タンパク質であることが示されています。したがって、APNは、抗体薬物複合体またはAPN特異的抗体に基づく新規ワクチンの開発において有望である。本研究では、従来のハイブリドーマ技術と遺伝子組換え抗体発現法を用いたAPN特異的モノクローナル抗体(mAb)の産生を比較した。また、pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APNとpET28a(+)-rAbs-APNベクターを保持する 大腸菌 発現BL21(DE3)株を使用して、安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を樹立しました。結果は、pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO細胞およびハイブリドーマを用いて産生されたmAbsで発現する抗体がAPNタンパク質を認識し、結合できることを示しています。これは、異なるAPN特異的エピトープを標的とする治療薬の開発のためのAPN受容体機能のさらなる解明の基礎を提供します。
Introduction
メタロプロテイナーゼM1ファミリーに属する月光酵素であるアミノペプチダーゼN(APN)は、酵素依存性および酵素非依存性の経路を介して腫瘍マーカー、受容体、およびシグナル伝達分子として機能します1,2。APNは、様々な生理活性ペプチドのN末端アミノ酸残基を切断してそれらの生物学的活性を調節することに加えて、様々な炎症性疾患の病因において重要な役割を果たす。APNは、主要組織適合遺伝子複合体クラスII分子に強固に結合するトリミングペプチドによる抗原プロセシングおよび提示に関与しています2,3。APNはまた、複数のシグナル伝達に関与するGタンパク質共役受容体と結合し、サイトカイン分泌を調節し、免疫応答におけるFcガンマ受容体媒介食作用に寄与することにより、抗炎症効果を発揮します4,5,6,7。
広く分布している膜結合型エキソペプチダーゼとして、APNはブタの小腸粘膜に豊富にあり、受容体媒介性エンドサイトーシスと密接に関連しています1,5,8。APNは、細胞侵入のために伝染性胃腸炎ウイルスのスパイクタンパク質を認識して結合し、毒素原性大腸菌F4線ブリアのFaeGサブユニットと直接相互作用して、宿主細胞との細菌接着に影響を与えます9,10,11。したがって、APNは、ウイルスおよび細菌感染症の治療における潜在的な治療標的である。
1975年にモノクローナル抗体(mAb)産生のためのハイブリドーマ技術およびその他の戦略が開発されて以来、mAbは免疫療法、薬物送達、および診断に広く使用されてきました12,13,14。現在、モノクローナル抗体は、癌、炎症性腸疾患、多発性硬化症などの疾患の治療に成功しています12,15。モノクローナル抗体は、その強力な親和性と特異性により、抗体薬物複合体(ADC)や新規ワクチンの開発において理想的な標的となり得る16,17。APNタンパク質は、抗原を特定の細胞に選択的に送達するために重要であり、低タンパク質発現、酵素不活性、または構造変化を含む干渉なしに、病原体に対する特異的で強力な粘膜免疫応答を誘発することができる5,8,18。したがって、APN特異的モノクローナル抗体に基づく治療用製品は、細菌およびウイルス感染に対して有望です。本研究では、ハイブリドーマ技術を用いたAPN特異的モノクローナル抗体の産生、および原核生物および真核生物ベクターを用いた抗APN組換え抗体(rAbs)の発現について述べる。この結果は、APNタンパク質がpIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO細胞およびハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体の両方で発現したrAbsによって認識されたことを示している。
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Protocol
この研究のすべての動物実験は、揚州大学施設動物管理および使用委員会(SYXK20200041)によって承認されました。
1. ブタAPNタンパク質抗原の調製
注:pET28a(+)-APN-BL21(DE3)株およびAPN安定発現細胞pEGFP-C1-APN-IPEC-J2は、以前の研究11で構築されました。
- 凍結グリセロールストックから細菌を回収し、50 μg/mLカナマイシン(Km+)を含むLuria-Bertani(LB)プレートにストリークして単一コロニーを分離します。
- 新たに縞模様のプレートから単一のコロニーを選択し、Km+( 50 μg/mL)を添加した4 mLのLB培地(10 g/Lトリプトン、10 g/L塩化ナトリウム(NaCl)および5 g/L酵母エキス、pH 7.2)で培養し、37°Cで攪拌(178 rpm)しながら一晩(12-16時間)増殖させます。
- 調製した細菌を新鮮なKm + LBブロスで1:100に希釈し、OD600 が0.4〜0.6に達するまで2〜3時間振とうしながら37°Cでインキュベートします。
- イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度0.4 mMになるまで培地に加え、培養液を16°Cでさらに10時間インキュベートします。
- したがって、IPTG誘導(10,000 × g、4°C15分)を使用して細菌を遠心分離および回収します。
- 1 mg/mLのリゾチームを含む5 mLのLEW(溶解/平衡化/洗浄)バッファー(50 mM無水リン酸ナトリウム一塩基(NaH2PO4)および300 mM NaCl、pH 8.0)を使用して、細胞ペレットを再懸濁します。氷上で30分間細菌懸濁液を攪拌し、超音波ホモジナイザーを使用して完全に超音波処理する(15秒パルスと20秒オフ、15分)。
- 粗細胞ライセートを4°C、10,000 × gで30分間遠心分離し、細胞破片を除去します。上清を事前に平衡化したカラムに移し、重力ドレナージの1〜2分前にインキュベートします。この手順を 3 回繰り返します。
- 20 mLのLEWバッファーを使用してカラムを洗浄し、重力を使用して排出します。9 mLの溶出バッファー(50 mM NaH2PO4、300 mM NaClおよび250 mM イミダゾール、pH 8.0)を使用してヒスチジンタグ付きAPNタンパク質を溶出し、透析チューブに回収します。
- タンパク質溶液を炭酸ナトリウム-炭酸水素ナトリウム(PBS、135 mM NaCl、4.7 mM 塩化カリウム、2 mM NaH 2 PO4、および10 mMリン酸ナトリウム二ナトリウム、pH7.2)バッファー中で4°Cで一晩透析します。
- 12.0% SDS-PAGEゲルとウェスタンブロッティングを使用して分析し、APNタンパク質の純度を評価します。
- 5 μgのタンパク質をゲルの各ウェルにロードし、110 Vで1.5時間稼働させます。次に、タンパク質をPVDFメンブレンに15 Vで50分間転写し、BCAアッセイを使用して精製タンパク質の濃度を決定します。
2.動物予防接種
- 皮下(s.c)は、6〜8週齢の雌のBALB / cマウスに、50μgのAPNタンパク質またはPBS(陰性対照)を2週間に1回アジュバントと混合して注射します。初回免疫には加熱死した抗酸菌を含む完全なフロイントアジュバントを使用し、ブースター免疫には不完全なフロイントアジュバントを使用してください。等量のAPNタンパク質(またはPBS)とフロイントアジュバントまたは不完全なフロイントアジュバントをそれぞれ混合します。
- 0.05 M PBS(pH 9.6)で希釈した5 μg/mL APNタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを使用した間接酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、これらのマウスの血清中のAPNに対する抗体価を検出します。.
3. APNに対するモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマ技術
- 腹腔内(i.p.)100 μgのAPNタンパク質を選択したマウスに注入し、最終的な抗原ブーストを行います。
- 3日後、ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg、v / v、腹腔内)と頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させます。
- 脾臓を採取し、DMEMで2回洗浄して血液と脂肪細胞を取り除きます。200メッシュの銅グリッドを使用して脾臓細胞懸濁液をろ過して組織破片を除去し、遠心分離(1500 × g、10分)を使用して脾臓細胞を採取して脾臓の膜を除去します。
- 6%ウシ胎児血清(FBS)を添加した5mLのDMEMを含む25cm2フラスコにマウス骨髄腫SP2/0細胞を播種し、細胞生存率を維持するために37°C、6%CO2雰囲気で培養した。5〜6日間の培養後、細胞は蘇生後に80%〜90%のコンフルエントに達し、増殖対数段階にあります。顕微鏡下では、細胞は丸く、明るく、透明です。
- ハイブリダイゼーションの1日前に、既報の方法12、19に従ってマウスの腹腔からマクロファージを採取する。
- 腹膜マクロファージを0.1-0.2×105 / mLの密度で96ウェルプレートに播種し、各ウェルには100 μLのHAT培地(10%FBSと1x HATサプリメントを添加したDMEM)を入れ、37°C、6%CO2 加湿雰囲気で一晩インキュベートします。
- ハイブリダイゼーションの場合は、SP2/0細胞を8〜10本のピペットで穏やかに吸引し、10 mLの無血清DMEM培地に懸濁します。細胞を新鮮なDMEMで洗浄し、遠心分離機(1500 × g、10分)を2回行った後、10 mLのDMEMに再懸濁します。
- 定量した脾臓細胞とSP2/0細胞を10:1の比率で混合し、50 mLチューブに移します。遠心分離機(1500×g、10分)し、上清を捨てる。チューブの底にある細胞ペレットを集め、手のひらで軽くたたいて、ハイブリダイゼーションの前にペレットを緩めます。
- ポリエチレングリコール1500(PEG 1500)1mLを加え、37°Cに予め加温し、チューブの底部を穏やかに回転させながら45秒間かけて緩めた細胞ペレットにスポイトを用いて滴下した。
- 37°Cに予温したDMEM1 mLを上記の混合物に90秒間かけてゆっくりと加え、続いてさらに30 mLの新鮮なDMEMを加えます。融合チューブを37°Cの水浴に30分間入れます。
- 温浴中でインキュベートした後、細胞を回収し、HAT培地に再懸濁する。その後、腹膜マクロファージを接種した96ウェルプレートで培養する。
- 5日後、100 μLの新鮮なHAT培地を各ウェルに加え、プレートをさらに5日間インキュベートした後、培地をHT培地(DMEMに10%FBSと1x HTサプリメントを添加したもの)と交換します。
- 0.05 M PBS(pH 9.6)で希釈した5 μg/mL APNタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、ELISAアッセイを使用してハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体を分析します。
- 96ウェルプレートのウェル内の培地が黄色に変わったら(細胞増殖と代謝産物の放出により、培地中のpHが6.8に低下し、フェノールレッドがフクシアから黄色に変わる)、または細胞クラスターが観察されたら、選択したウェルから100 μLの上清を取得し、コーティングされたELISAプレートのウェルに追加します。マイクロプレートリーダーを使用してOD450の値を測定します。
- APNおよび非感染マウス血清に対するポリクローナル抗体をそれぞれ陽性および陰性対照として使用し、PBSをブランク対照として使用する。本研究では、陰性対照に対するサンプルのOD450比(P/N)≥2.1が陽性選択基準として認められた。
- 3回連続したポジティブ選択ラウンドの後、限られた希釈アッセイのためにAPNタンパク質に対する血清学的応答の増加を示すハイブリドーマを選択します。
- 前述のように、腹膜マクロファージとシードを96ウェルプレートで調製します。
- ハイブリドーマ細胞をHT培地中で1ウェル当たり平均0.5-2細胞で懸濁し、37°C、6%CO2 インキュベーター内で培養する。ELISAイムノアッセイで示される陽性率が100%に達するまで、この手順を3〜4回繰り返します。
- 連続凍結融解の圧力下で、抗APN抗体を安定して分泌し、正常に増殖できる陽性ハイブリドーマ細胞を選択します。
- 各マウスに0.3 mLのプリスタンの単回i.p.注射を投与します(8〜10週間)。手付かずの投与後10日目に、各マウスに0.5mLのPBS(pH 7.2)中の2〜5 x 105 ハイブリドーマ細胞を注射する。
- 注射後8〜10日目にこれらのマウスの腹腔から腹水を注意深く収集する。
- 5,000 × gで15分間遠心分離して上清を回収し、33%飽和硫酸アンモニウム[(NH4)2SO4]沈殿およびプロテインAアガロースを用いて上清中の抗体を精製します。
4. APNタンパク質に対するモノクローナル抗体の特性評価
- SBAクロノタイピングシステム-HRP20を使用して、収集されたモノクローナル抗体の免疫グロブリンサブタイプを決定します。SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを使用して、モノクローナル抗体の純度と特異性を評価します。
- ELISA21を用いてAPNタンパク質に対するmAbエピトープ特異性を解析します。加法値(AV)は、OD mAbs(a+b)と(ODmAbs-a+OD mAbs-b)の比であり、モノクローナル抗体が同じ抗原部位を認識するかどうかを評価するために使用されます。OD mAbs-aおよびOD mAbs-bはAPN単独に対する異なるモノクローナル抗体のOD450値を表し、ODmAbs(a+b)はAPNに対する2つのモノクローナル抗体の1:1混合物のOD450値を表します。
- 各サンプルを少なくとも4回の反復で評価し、実験全体を少なくとも3回繰り返します。
5. APNに対するラブの発現
- APN免疫マウスの上記のハイブリドーマ細胞および脾臓から全RNAを抽出する(例えば、TRIzol)22。製造元の指示に従って、cDNA合成キットを使用して相補的DNA(cDNA)を合成します。
- ネストされたPCRを使用してモノクローナル抗体の可変領域を増幅し、シーケンシングを使用して重鎖(VH)および軽鎖(VL)配列を決定します。IMGTマウスゲノム解析ツールを用いてVHおよびVLをコードする遺伝子を解析する(http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php)。
- VH遺伝子とVL遺伝子をリーダー配列と組み合わせ、シームレスなクローニング技術を使用して、それぞれpET28a(+)およびpIRES2-ZsGreen1ベクターに順次サブクローニングして、傷のないDNAフラグメント挿入を可能にします。具体的なプライマーを 表1に記載する。
- pET28a(+)-rAbs-APN-BL21形質転換細菌を、0.4 mM IPTG存在下、オービタルシェーカー中で37°Cで10時間増殖させます。次に、ルーチンのタンパク質精製を使用して、rAbsタンパク質の発現を誘導、精製、および評価します。
- ウェルあたり100 μL 0.5 x 105 CHO細胞を96ウェルプレートに播種し、6%CO2 雰囲気中で37°Cで18〜24時間インキュベートします。細胞が80-90%のコンフルエントに達したら、pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APNプラスミドをOpti-MEMで最終濃度0.1 μg/μLに希釈し、室温で5分間インキュベートしてからトランスフェクションに使用します。
- 50 μLの希釈pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APNプラスミドを1 μLのリポフェクタミン2000および49 μLのOpti-MEMと穏やかに混合し、室温でさらに20分間インキュベートします。CHO細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに100 μLの混合物を添加し、6%CO2 雰囲気中37°Cで4〜6時間インキュベートします。
- トランスフェクション後4〜6時間で、培地を10%FBSを添加したDMEM-F12培地と交換し、プレートをさらに48時間インキュベートします。次に、400 μg/mL G418を各ウェルに追加し、安定にトランスフェクトされた細胞を選択します。
- 10%FBSおよび400 μg/mL G418を添加したDMEM-F12培地を用いて10日間選択した後、蛍光活性化細胞ソーティングにより細胞(3.0×107 細胞/mL)をソーティングします。細胞集団の約10〜15%が陽性であった。
- 回収した陽性細胞を段階的に希釈し、96ウェルプレート中でウェル当たり平均0.5〜2細胞で播種し、37°C、6%CO2 インキュベーター内で培養した。G418(200 μg/mL)による選択を使用して、安定にトランスフェクトされたpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞を維持します。
- 上述の細胞培養培地中のFBS濃度は、3週間の期間にわたって対数増殖期の間に10%から0%に徐々に減少する。次いで、接着したCHO細胞を無血清培地中での懸濁増殖に適応させる。
- 播種したpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞を無血清培地中で0.8-1.0×105 細胞/mLの密度で、振とうフラスコ中で80-110 rpmの振とう速度、37°C、6%CO2で培養します。
- 12時間ごとに細胞懸濁液を採取し、製造元の指示に従って細胞計数キット(CCK-8など)を使用して細胞の生存率と活力の変化を測定します。
- 抗体発現は、細胞生存率が80%に低下し、細胞密度が106 細胞/mL×1.0〜2.0に達するとピークレベルに達します。遠心分離を用いて細胞上清を回収し、0.22 μmポリテトラフルオロエチレンメンブレンフィルターを用いてフィルターし、プロテインAアガロースを用いて精製する。
- 間接免疫蛍光アッセイ(IFA)を用いてAPN特異的抗体の産生を確認します。
- 抗体価および結合親和性は、前述のようにELISAアッセイを用いて決定する。23 ソフトウェアを用いて抗体の平衡解離定数(KD 値)を4パラメータロジスティック方程式で計算する。
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Representative Results
この研究では、精製された可溶性APNタンパク質(2.12 mg / mL)をマウスの免疫に使用しました。APNタンパク質を14日間隔で4回免疫したマウスは、血清中のAPNに対するより高い抗体価を示した。融合実験により14個のハイブリドーマが得られたが、3回の連続凍結融解サイクルを生き延びたハイブリドーマは9個のみであり、APNに対する抗体を分泌する9個の安定クローンが得られた。これらのセルはすべて丸く、明るく、透明です(図1)。重鎖と軽鎖(それぞれ50 kDaと25 kDa)を有する精製モノクローナル抗体をSDS-PAGEで確認し、精製腹水に見出しました(図2)。培養上清および腹水におけるこれらの抗APN mAbの力価を 表2に示す。
マウスモノクローナル抗体のアイソタイピングの結果、クローン5B31、5B36、3C48、5C51、および6C56に由来するモノクローナル抗体はIgG2bサブクラスを有し、APN-2A20はIgG2aκappa-(κ)型抗体であり、mAb APN-3FD9、-3F10、および-10F3はIgM型およびプロセシングされたκ軽鎖に属することが明らかになりました(表3)。 表4に示すように、これらのモノクローナル抗体のほとんどは50%以上のAV値を示し、APNの異なるエピトープを標的としているのに対し、APN-5C51抗体はAPN-3C48、-5B31、および-6C56 mAbで認識されるものと同様の抗原エピトープを認識したことを示しています。
APN-5B36は、他のモノクローナル抗体と比較してかなり高い抗体価を示しました。そこで、APN-5B36 VH-VL遺伝子を増幅し、pET28a(+)またはpIRES2-ZsGreen1ベクターにライゲーションして、組換え発現プラスミドpET28a(+)-rAbs-APNおよびpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APNをそれぞれ構築しました(図3)。pET28a(+)-rAbs-APN-BL21(DE3)およびpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞の両方によって発現された抗体を精製し、ELISAおよびIFAアッセイを用いて分析した。しかし、図4に示すように、pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞の上清で発現した抗体のみがAPNタンパク質を認識し、ハイブリドーマ由来のmAbも認識した。この組換え抗体は、IgG2b重鎖およびラムダ軽鎖からなり、ELISAを用いて測定した2.56×105の力価を示した。APN-5B36 mAbのAPNタンパク質への結合は、rAbよりも早く平衡に達し(図5)、10-9×10-8 mol/LのKD値がそれぞれ(4.232±0.475)および(2.201±0.367)×10-8 mol/Lを示しました。
| 入門 | シーケンス (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGGGGCCGGTAGACMGATGGGGCTG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGGCGCGGCAGCAGGGCGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG | ||
| pIRES2-Zsグリーン1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-Zsグリーン1-R | GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG | ||
表 1.本試験で用いた特異的プライマー。
| 細胞 | 上清の力価(U/mL) | 腹水の力価(U/mL) |
| 2A20 | 0.64×104 | 3.20×105 |
| 5B31 | 1.28×104 | 1.60×105 |
| 5B36 | 0.64×104 | 1.28×106 |
| 3C48 | 0.16×104 | 0.80×105 |
| 5C51 | 0.16×104 | 0.80×104 |
| 6C56 | 0.80×103 | 0.80×104 |
| 3FD9 | 0.80×103 | 0.80×104 |
| 3F10 | 0.16×104 | 0.16×105 |
| 10F3 | 0.80×103 | 0.32×105 |
表 2.APNモノクローナル抗体のELISA力価。
| イグ | IgA | IgM | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | カッパ | ラムダ | 概要 | |
| 2A20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, カッパ |
| 5B31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, ラムダ |
| 5B36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, ラムダ |
| 3C48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, ラムダ |
| 5C51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, ラムダ |
| 6C56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, ラムダ |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, カッパ |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, カッパ |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, カッパ |
表 3.ハイブリドーマ由来APN mAbのアイソタイプ。
| モノクローナル抗体 | AV (100 %) | ||||||||
| 2A20 | 5B31 | 5B36 | 3C48 | 5C51 | 6C56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2A20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5B31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5B36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3C48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5C51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6C56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
表 4.APN特異的モノクローナル抗体の抗原エピトープ特異性の識別。 0.5より大きいAV値は、これら2つのモノクローナル抗体が異なる抗原部位を認識することを示します。0.5未満のAV値は、これら2つのモノクローナル抗体が類似の抗原部位を認識することを示します。
図 1.ハイブリドーマの画像。 顕微鏡分析では、ハイブリドーマは丸く、明るく、透明です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.組換え抗体発現レベルおよび腹水をSDS-PAGEを用いて分析した。(a)レーンM、タンパク質マーカー;レーン1、精製PET28a(+)-ラブス-APN-BL21(DE3)ライセート;レーン2、PET28a(+)-ラブス-APN-BL21(DE3)上清;レーン3は、33%(NH4)2SO4沈殿によって精製された腹水。(b)レーンM、タンパク質マーカー;レーン1は、プロテインAアガロースを用いて精製した腹水である。このアッセイでは、3〜5μgの総タンパク質をゲルの各レーンにロードしました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.組換え発現プラスミドpET28a(+)-rAbs-APNおよびpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APNをアガロースゲル電気泳動を用いて分析した。 レーンM、トランス2KプラスDNAマーカー。レーン1、PET28a(+)ベクトル(5369 bp);レーン2および5、APN-5B36リーダー配列と組み合わせたVH-VL遺伝子;レーン3、BL21(DE3)大腸 菌で発現したpET28a(+)-rAbs-APNプラスミド;レーン4、pIRES2-ZsGreen1ベクトル(5283 bp);レーン6は、DH5α 大腸菌で発現したpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APNプラスミドである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.組換え抗体タンパク質および腹水の発現を間接免疫蛍光法を用いて分析した。 APNを安定に発現するpEGFP-C1-APN-IPEC-J2細胞(緑色蛍光)を(A)PBSで処理し、対照処理として用いる;(b)pET28a(+)-rAbs-APN-BL21(DE3)により発現される精製タンパク質;(c)APNポリクローナル抗体(1:500);(d)精製腹水(1:500);E)pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞から得られた精製上清(1:500)。DAPIは、共焦点顕微鏡の核対比染色として使用されました。DyLight 549結合ヤギ抗マウスIgG二次抗体(1:200)とともにインキュベートし、精製腹水で処理し、pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞からの精製上清で処理した細胞は、APNポリクローナル抗体と同様に堅牢な赤色蛍光シグナルを示しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.抗体の相対的な結合親和性の決定はELISA22を用いた。APN-5B36 mAbsまたはrAbsを含む試料の吸収は、APNタンパク質の非存在下および存在下で、波長450nmで測定した。結合曲線は、4パラメータロジスティック曲線フィットを使用してプロットしました。X軸は抗体の対数濃度を示し、Y軸は吸光度を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
粘膜免疫の誘導は、病原体に対抗し、さまざまな疾患の予防と治療において最も効果的なアプローチの1つです。腸粘膜で高発現する膜結合タンパク質であるAPNは、適応免疫応答の誘導および受容体媒介性のウイルスおよび細菌のエンドサイトーシスに関与しています1,5,8。APNは、抗原負荷およびワクチン送達の多くの形態において抗原粒子として使用されている。APN標的抗体の経口投与はまた、効果的な免疫応答を誘発することができる18、24、25。ただし、異なるAPN特異的エピトープを標的とするモノクローナル抗体は、さらなる調査が必要です。
ここで説明した方法は、従来のハイブリドーマと組換え技術の両方を使用してAPNに対するモノクローナル抗体を産生するために採用されました。このアプローチは、他のモノクローナル抗体の製造にも使用できます。まず、前述のプロトコルに従って、異なるハイブリドーマクローンに由来する9つのモノクローナル抗体を取得しました。細胞上清と腹水中のこれらのモノクローナル抗体の力価は異なっていましたが、すべてのモノクローナル抗体は50 kDaの重鎖と25 kDaの軽鎖を含み、ブタAPNタンパク質との特異的結合を示しました。抗原エピトープのアイソタイピングと同定の結果は、ほとんどのモノクローナル抗体が異なるエピトープを標的とし、異なる抗体タイプに属することを示しました。これらの結果は、従来のハイブリドーマ技術がモノクローナル抗体の生産において依然として有効な選択肢であることを示しています。
組換え抗体の生産に使用されるアプローチは、モノクローナル抗体の生産効率を高め、人件費と時間に関連するコストを最小限に抑えることができます。したがって、これらのアプローチは、特に診断および治療用途のための抗体の開発において人気が高まっている16、17、26。rAbは、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体に比べていくつかの利点を示す。まず、抗体遺伝子を発現ベクターにクローニングすることにより、in vitroでrAbを産生することができ、それによって抗体産生における動物の使用を排除することができる。さらに、真核生物または原核生物の発現システムを使用してrAbを生成すると、バッチ間のばらつきが少なくなり、最終製品の信頼性と安定性が向上します。対照的に、ハイブリドーマを用いて作製されたモノクローナル抗体は、標的抗原エピトープを認識または結合しないことが多く、ハイブリドーマ細胞株のドリフト、コンタミネーション、遺伝子の喪失および突然変異の影響を受けます。現在、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体は主に診断用または治療用免疫試薬に使用されており、限られた生産期間で安定した信頼性の高い抗体を産生する必要性が浮き彫りになっています。診断および治療アプリケーションには、従来のハイブリドーマベースのアプローチよりも組換え抗体技術の方が適しています。これは、遺伝子組換え抗体技術により、rAbの配列を改変して免疫グロブリンアイソタイプを切り替えることができ、それによって抗体の結合特異性を高めることができるためです14,16,17。
本研究では、抗体工学技術を用いてAPN標的組換え抗体を作製しました。我々は、免疫マウスの脾臓およびハイブリドーマ細胞の両方が、mAb重鎖および軽鎖配列の増幅に同様に有効であることを見出した。pET28a(+)-rAbs-APN-BL21(DE3)によって発現された抗体は、ELISAまたは間接免疫蛍光アッセイのいずれにおいてもAPNを効果的に認識しませんでした。しかしながら、pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞懸濁液およびハイブリドーマ由来mAbsによって発現されたrAbは、APNタンパク質を認識し、効果的に結合した。この研究に記載されている方法は、APN抗体ベースのADCおよびさまざまなAPN特異的エピトープを標的とする他の治療製品を開発するために使用できます。この研究は、さまざまな病気の予防と治療におけるAPNの役割をさらに明らかにするのに役立ちます。しかし、rAbの親和性と収量を改善するための戦略は、さらなる調査が必要です。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。すべての著者は、原稿の出版を承認し、明示的な同意を与えました。
Acknowledgments
この研究は、中国国家科学基金会助成金(第32072820号、31702242)、江蘇省政府海外研究奨学金(JS20190246)からの助成金、および江蘇省高等教育機関開発優先学術プログラムによって設立されたプロジェクトである揚州大学科学研究基金会の高レベルの才能によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
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