Produktion av monoklonala antikroppar riktade mot aminopeptidas N i svinets tarmslemhinneepitel
Summary
Det rekombinanta antikroppsproteinet uttryckt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler och monoklonala antikroppar producerade med traditionell hybridomteknik kan känna igen och binda till svinaminopeptidas N (APN) -proteinet.
Abstract
Svinaminopeptidas N (APN), ett membranbundet metallopeptidas som finns rikligt i tunntarmslimhinnan, kan initiera ett slemhinneimmunsvar utan störningar såsom lågt proteinuttryck, enzyminaktivitet eller strukturella förändringar. Detta gör APN till en attraktiv kandidat i utvecklingen av vacciner som selektivt riktar sig mot slemhinneepitelet. Tidigare studier har visat att APN är ett receptorprotein för både enterotoxinproducerande Escherichia coli (E. coli) F4 och överförbart gastroenteritvirus. Således visar APN löfte i utvecklingen av antikropps-läkemedelskonjugat eller nya vacciner baserade på APN-specifika antikroppar. I denna studie jämförde vi produktion av APN-specifika monoklonala antikroppar (mAbs) med traditionell hybridomteknik och rekombinant antikroppsuttrycksmetod. Vi etablerade också en stabilt transfekterad kinesisk hamsteräggstockscellinje (CHO) med pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN och en E. coli-uttryck BL21 (DE3) stam som innehåller pET28a (+) -rAbs-APN-vektorn. Resultaten visar att antikroppar uttryckta i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler och mAbs producerade med hybridom kunde känna igen och binda till APN-proteinet. Detta utgör grunden för ytterligare klarläggande av APN-receptorns funktion för utveckling av läkemedel riktade mot olika APN-specifika epitoper.
Introduction
Aminopeptidas N (APN), ett månskensenzym som tillhör metalloproteinas M1-familjen, fungerar som en tumörmarkör, receptor och signalmolekyl via enzymberoende och enzymoberoende vägar 1,2. Förutom att klyva N-terminala aminosyrarester av olika bioaktiva peptider för reglering av deras biologiska aktivitet spelar APN en viktig roll i patogenesen av olika inflammatoriska sjukdomar. APN deltar i antigenbearbetning och presentation av trimmade peptider som binder tätt till stora histokompatibilitetskomplexa klass II-molekyler 2,3. APN utövar också antiinflammatoriska effekter genom att binda med G-proteinkopplade receptorer som deltar i multipel signaltransduktion, modulerar cytokinsekretion och bidrar till Fc-gammareceptormedierad fagocytos i immunsvaret 4,5,6,7.
Som ett brett distribuerat membranbundet exopeptidas är APN rikligt i svinets tunntarmslimhinna och är nära associerad med receptormedierad endocytos 1,5,8. APN känner igen och binder spikproteinet hos det överförbara gastroenteritviruset för cellinträde och interagerar direkt med FaeG-underenheten av enterotoxinbildande Escherichia coli F4-fimbrier för att påverka bakteriell vidhäftning med värdceller 9,10,11. Således är APN ett potentiellt terapeutiskt mål vid behandling av virus- och bakterieinfektionssjukdomar.
Sedan utvecklingen av hybridomteknik och andra strategier för monoklonala antikroppar (mAbs) produktion 1975 har mAbs använts i stor utsträckning inom immunterapi, läkemedelsleverans och diagnos12,13,14. För närvarande används mAbs framgångsrikt för att behandla sjukdomar, såsom cancer, inflammatorisk tarmsjukdom och multipel skleros12,15. På grund av deras starka affinitet och specificitet kan mAbs vara idealiska mål vid utveckling av antikropps-läkemedelskonjugat (ADC) eller nya vacciner16,17. APN-proteinet är avgörande för att selektivt leverera antigener till specifika celler och kan framkalla ett specifikt och starkt mukosalt immunsvar mot patogener utan störningar inklusive lågt proteinuttryck, enzyminaktivitet eller strukturella förändringar 5,8,18. Därför visar terapeutiska produkter baserade på APN-specifika mAbs löfte mot bakteriella och virusinfektioner. I denna studie beskriver vi produktionen av APN-specifika mAbs med hjälp av hybridomteknik och uttryck av anti-APN-rekombinanta antikroppar (rAbs) med hjälp av prokaryota och eukaryota vektorer. Resultatet indikerar att APN-proteinet kändes igen av både rAbs uttryckt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler och hybridom-härledda mAbs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Induktion av slemhinneimmunitet är ett av de mest effektiva tillvägagångssätten för att motverka patogener och förebygga och behandla olika sjukdomar. APN, ett starkt uttryckt membranbundet protein i tarmslemhinnan, är involverat i induktionen av adaptivt immunsvar och i receptormedierad viral och bakteriell endocytos 1,5,8. APN används som antigenpartiklar i många format av antigenladdning och vaccinleverans. Den orala…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Chinese National Science Foundation Grant (nr 32072820, 31702242), bidrag från Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) och High-level Talents of Yangzhou University Scientific Research Foundation, ett projekt grundat av Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient’s need. British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
