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Cancer Research

चूहों में ट्यूमर-घुसपैठ सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए ट्यूमर प्रत्यारोपण

Published: June 12, 2021 doi: 10.3791/62442
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 1, 5, 1
1Institute of Immunology, Third Military Medical University, 2Guanghua School of Stomatology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Stomatological Hospital, Sun Yat-Sen University, 3Shigatse Branch, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, 4Department of Emergency Medicine, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 5Cancer Center, The General Hospital of Western Theater Command

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां, हम माउस ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर-अंतर्निहित और परिधि-व्युत्पन्न ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइट्स के लक्षण वर्णन के लिए एक ट्यूमर प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रवाह साइटोमेट्री के साथ प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आमद का विशिष्ट पता लगाने से एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के दौरान इन कोशिकाओं के फेनोटाइपिक और कार्यात्मक परिवर्तनों की गतिशीलता का पता चलता है।

Abstract

टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा ट्यूमर के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (सीटीएल) कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने में अग्रणी भूमिका निभाती है। हालांकि, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) के भीतर ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की उत्पत्ति और पुनःपूर्ति अस्पष्ट रहती है। यह प्रोटोकॉल B16F10-OVA मेलेनोमा सेल लाइन को नियोजित करता है, जो सरोगेट नियोएंटीजन, ओवलबुमिन (ओवीए), और टीसीआर ट्रांसजेनिक ओटी-आई चूहों को स्थिर रूप से व्यक्त करता है, जिसमें 90% से अधिक सीडी 8 + टी कोशिकाएं विशेष रूप से ओवीए-व्युत्पन्न पेप्टाइड ओवीए257-264 (SIINFEKL) को पहचानती हैं जो कक्षा I प्रमुख हिस्टोकॉम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) अणु एच 2-केबी से बंधी हैं। ये विशेषताएं एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम करती हैं।

ट्यूमर प्रत्यारोपण सर्जरी के साथ इस मॉडल के संयोजन, दाताओं से ट्यूमर ऊतकों को ट्यूमर-मिलान सिंजेनिक प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था ताकि प्रतिरोपित दाता ऊतकों में प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आमद का सटीक पता लगाया जा सके, जिससे ट्यूमर-अंतर्निहित और परिधि-उत्पन्न एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण की अनुमति मिलती है। टी कोशिकाओं. इन दो आबादी के बीच एक गतिशील संक्रमण पाया गया। सामूहिक रूप से, इस प्रयोगात्मक डिजाइन ने टीएमई में सीडी 8 + टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की सटीक जांच करने के लिए एक और दृष्टिकोण प्रदान किया है, जो ट्यूमर इम्यूनोलॉजी पर नया प्रकाश डालेगा।

Introduction

CD8 + T सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ट्यूमर के विकास को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। के दौरान, भोले सीडी 8 + टी कोशिकाएं एक एमएचसी वर्ग I-प्रतिबंधित तरीके से एंटीजन मान्यता पर सक्रिय हो जाती हैं और बाद में प्रभावकारी कोशिकाओं में अंतर करती हैं और ट्यूमर द्रव्यमान 1,2 में घुसपैठ करती हैं। हालांकि, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) के भीतर, लंबे समय तक एंटीजन एक्सपोजर, साथ ही साथ इम्यूनोसप्रेसिव कारक, ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को एक हाइपोरेस्पॉन्सिव राज्य में घुसपैठ करते हैं जिसे "थकावट" 3 के रूप में जाना जाता है। थका हुआ टी कोशिकाएं (टेक्स) तीव्र वायरल संक्रमण में उत्पन्न प्रभावक या स्मृति टी कोशिकाओं से अलग होती हैं, दोनों ट्रांसक्रिप्शनल और एपिजेनेटिक रूप से। इन टेक्स कोशिकाओं को मुख्य रूप से निरोधात्मक रिसेप्टर्स की एक श्रृंखला की निरंतर और उन्नत अभिव्यक्ति के साथ-साथ प्रभावकारी कार्यों के पदानुक्रमित नुकसान की विशेषता है। इसके अलावा, थका हुआ सीडी 8 + टी कोशिकाओं की बिगड़ा हुआ प्रोलिफेरेटिव क्षमता के परिणामस्वरूप ट्यूमर-विशिष्ट टी कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है, जैसे कि टीएमई के भीतर अवशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाएं ट्यूमर की प्रगति3 के खिलाफ पर्याप्त सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रदान कर सकती हैं। इस प्रकार, इंट्राट्यूमरल एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का रखरखाव या सुदृढीकरण ट्यूमर दमन के लिए अपरिहार्य है।

इसके अलावा, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नाकाबंदी (आईसीबी) थेरेपी को टी सेल घुसपैठ को बढ़ाकर ट्यूमर में टेक्स को पुनर्जीवित करने के लिए माना जाता है और इसलिए, टी सेल संख्या और ट्यूमर दमन को बढ़ावा देने के लिए टी सेल कार्यों को पुनर्जीवित करना। आईसीबी उपचार के व्यापक अनुप्रयोग ने कैंसर थेरेपी परिदृश्य को बदल दिया है, जिसमें टिकाऊ प्रतिक्रियाओं का अनुभव करने वाले रोगियों का एक पर्याप्त सबसेट 4,5,6 है। फिर भी, अधिकांश रोगी और कैंसर के प्रकार आईसीबी का जवाब नहीं देते हैं या केवल अस्थायी रूप से प्रतिक्रिया करते हैं। टीएमई में अपर्याप्त टी सेल घुसपैठ को आईसीबी प्रतिरोध 7,8 के लिए लेखांकन अंतर्निहिततंत्रों में से एक माना गया है।

कई अध्ययनों ने रोगियों और माउस मॉडल 9,10,11,12 दोनों में ट्यूमर-घुसपैठ सीडी 8 + टी कोशिकाओं (टीआईएल) की विषमता का प्रदर्शन किया है। यह पुष्टि की गई है कि ट्यूमर द्रव्यमान में टी सेल फैक्टर -1 (टीसीएफ 1) को व्यक्त करने वाली सीडी 8 + टी कोशिकाओं का एक सबसेट स्टेम सेल जैसे गुणों को प्रदर्शित करता है, जो आगे समाप्त टी कोशिकाओं को जन्म दे सकता है और आईसीबी थेरेपी 12,13,14,15,16,17,18,19,20 के बाद प्रसार फटने के लिए जिम्मेदार है, 21,22. हालांकि, यह साबित हो गया है कि टीएमई में एंटीजन-विशिष्ट टीसीएफ 1 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं का केवल एक छोटा सा अनुपात मौजूद है और आईसीबी 23,24,25,26 के जवाब में विभेदित संतानों का एक विस्तारित पूल उत्पन्न करता है। क्या इस आबादी का सीमित आकार ट्यूमर की प्रगति को नियंत्रित करने के लिए साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (सीटीएल) की दृढ़ता सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है, यह अज्ञात है, और क्या परिधि ऊतकों से पुनःपूर्ति है, आगे की जांच की आवश्यकता है। इसके अलावा, हाल के शोध से पता चलता है कि पहले से मौजूद ट्यूमर-विशिष्ट टी कोशिकाओं की अपर्याप्त पुनरुत्थान क्षमता और उपन्यास की उपस्थिति, एंटी-प्रोग्राम्ड सेल डेथ प्रोटीन 1 उपचार के बाद पहले गैर-मौजूदा क्लोनोटाइप। यह इंगित करता है कि चेकपॉइंट नाकाबंदी के लिए टी सेल प्रतिक्रिया टी सेल क्लोन27 के एक अलग प्रदर्शनों की सूची की नई आमद के कारण हो सकती है। टीएमई में बायस्टैंडर गैर-ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील साइटोटॉक्सिक टी सेल अंश की उपस्थिति के साथ, इन निष्कर्षों ने परिधि-व्युत्पन्न सीडी 8 + टी कोशिकाओं11 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक ट्यूमर एलोग्राफ्ट मॉडल की स्थापना को प्रेरित किया।

अब तक, कई प्रकार के ट्यूमर आरोपण, साथ ही साथ प्रतिरक्षा कोशिका दत्तक हस्तांतरण, ट्यूमर इम्यूनोलॉजी28 के क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। टीआईएल, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं, और अन्य ऊतकों से उत्पन्न ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इन तरीकों का उपयोग करके अच्छी तरह से विशेषता दी जा सकती है। हालांकि, प्रणालीगत और स्थानीय एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा के बीच बातचीत का अध्ययन करते समय, ये मॉडल परिधि और टीएमई से व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत की जांच करने के लिए अपर्याप्त दिखाई देते हैं। यहां, ट्यूमर के ऊतकों को दाताओं से ट्यूमर-मिलान प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था ताकि प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आमद का सटीक रूप से पता लगाया जा सके और टीएमई में दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं का सहवर्ती रूप से निरीक्षण किया जा सके।

इस अध्ययन में, मेलेनोमा का एक मुरीन सिंजेनिक मॉडल बी 16 एफ 10-ओवीए मेलेनोमा सेल लाइन के साथ स्थापित किया गया था, जो सरोगेट नियोएंटीजेन ओवलबुमिन को स्थिर रूप से व्यक्त करता है। टीसीआर ट्रांसजेनिक ओटी-आई चूहों, जिसमें सीडी 8 + टी कोशिकाओं के 90% से अधिक विशेष रूप से ओवीए-व्युत्पन्न पेप्टाइड ओवीए257-264 (SIINFEKL) को पहचानते हैं, जो कक्षा I MHC अणु H2-K b से बंधे होते हैं,B16F10-OVA ट्यूमर मॉडल में विकसित एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम करते हैं। ट्यूमर प्रत्यारोपण के साथ इस मॉडल के संयोजन से, ट्यूमर-अंतर्निहित और परिधि-उत्पन्न एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की तुलना इन दो आबादी के बीच एक गतिशील संक्रमण को प्रकट करने के लिए की गई थी। सामूहिक रूप से, इस प्रयोगात्मक डिजाइन ने टीएमई में सीडी 8 + टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की सटीक जांच करने के लिए एक और दृष्टिकोण प्रदान किया है, जो टीएमई में ट्यूमर-विशिष्ट टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता पर नया प्रकाश डालता है।

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Protocol

सभी माउस प्रयोगों को तीसरे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों के दिशानिर्देशों के अनुपालन में किया गया था। 6-8-सप्ताह पुराने C57BL / 6 चूहों और भोले OT-I ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करें जो 18-22 ग्राम वजन करते हैं। यादृच्छिककरण या "अंधा" के बिना पुरुष और महिला दोनों का उपयोग करें।

1. मध्यम और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. सेल कल्चर माध्यम D10 तैयार करें जैसा कि पहले 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 U / mL पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन को डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम में जोड़कर29 वर्णित किया गया था।
  2. 10% FBS, 100 U / mL पेनिसिलिन, और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ RPMI-1640 को पूरक करके सेल संस्कृति माध्यम R10 तैयार करें।
    नोट: संस्कृति मीडिया, D10 और R10, 2-4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर कम से कम 2 सप्ताह के लिए बाँझ और स्थिर रह सकते हैं।
  3. 2% FBS और सोडियम azide के 0.01% के साथ 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) पूरक द्वारा प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS) बफर तैयार करें।
    नोट: सोडियम azide के अलावा के साथ, FACS बफर महीनों के लिए 2-4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, और 0.1 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) को डबल-आसुत पानी में जोड़कर लाल रक्त कोशिका लाइसिस (RBL) बफर तैयार करें, और इसके पीएच को 7.3 पर समायोजित करें।
    नोट: RBL बफ़र कमरे के तापमान (RT) पर 3 महीने तक के लिए स्थिर है।
  5. 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) और 2 एमएम ईडीटीए के साथ पीबीएस के पूरक द्वारा चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) बफर तैयार करें।
    नोट: अभिकर्मक भंग हो गया है और एसेप्सिस में संरक्षित किया गया है के बाद समाधान एक 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से पारित किया जाना चाहिए।
  6. 2,2,2-tribromoethanol का एक काम समाधान तैयार करें।
    1. 2.5 ग्राम 2,2,2-tribromoethanol tert-amyl अल्कोहल (2-मिथाइल-2-butanol) के 5 मिलीलीटर में भंग करें। एक वाष्प स्नान में हलचल, 180 आरपीएम पर निरंतर तापमान वाइब्रेटर, 40 डिग्री सेल्सियस रात भर.
    2. एक बाँझ कंटेनर में एक 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें। 200 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा तक डबल-आसुत पानी जोड़ें, और समाधान स्पष्ट और पारदर्शी होने तक अच्छी तरह से और लगातार मिलाएं।
    3. निर्धारित करें और समाधान के pH मान को 7.3 करने के लिए समायोजित करें। पूरी तरह से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कंटेनर लपेटें प्रकाश को बाहर करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए।
      नोट: 2,2,2-tribromoethanol के काम करने वाले समाधान की अंतिम एकाग्रता 12.5 मिलीग्राम / एमएल है। एक अधिक केंद्रित समाधान की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि सामग्री उच्च सांद्रता में परेशान होती है। प्रत्येक उपयोग से पहले कार्यशील समाधान के pH मान का परीक्षण करें, और यदि pH 5 से कम है, तो इसे छोड़ दें।

2. B16F10-ओवीए सेल निलंबन की तैयारी

नोट: सेल संस्कृति को सख्त एसेप्टिक परिस्थितियों में एक जैव सुरक्षा हुड में किया जाना चाहिए।

  1. Thaw और संस्कृति B16F10-OVA कोशिकाओं की एक शीशी D10 के साथ एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर।
  2. जब कोशिकाएं लगभग 80-90% की confluency तक पहुंचती हैं, तो कोशिकाओं को उपसंस्कृति करें।
    1. एक pipettor के साथ संस्कृति माध्यम निकालें, और पीबीएस का उपयोग कर दो बार कोशिकाओं कुल्ला।
      नोट: फ्लास्क या सेल संस्कृति पकवान में अनुयायी कोशिकाओं के खिलाफ बलपूर्वक PBS न जोड़ें। इसके बजाय, पीबीएस को साइडवॉल की ओर पिपेट करें या इसे फ्लास्क या डिश में ड्रॉप-वार जोड़ें।
    2. पीबीएस को हटा दें, और फ्लास्क या डिश में 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 1-2 एमएल जोड़ें। पूरे सेल की सतह को कवर करने के लिए इसे आगे और पीछे रॉक करें। फ्लास्क या डिश को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 1 मिनट के लिए या आरटी पर रखें जब तक कि कोशिकाएं अलग न हो जाएं।
      नोट:: एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि क्या कोशिकाएं अलग हो गई हैं।
    3. ट्रिप्सिनाइजेशन को रोकने के लिए ताजा D10 जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं को फ्लास्क या डिश की सतह से अलग किया जाता है, निलंबन को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    4. B16F10-OVA सेल निलंबन को 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। RT पर 5-7 मिनट के लिए 125 × g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. supernatant को छोड़ दें, और D10 के साथ सेल गोली resuspend। B16F10-OVA सेल निलंबन को एक नए फ्लास्क या सेल कल्चर डिश में वितरित करें जिसमें D10 होता है और 37 °C और 5% CO2 पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  3. ट्यूमर आरोपण के दिन, फसल B16F10-OVA कोशिकाओं कि ~ 90% confluent के रूप में चरण 2.2.1 से 2.2.4 में वर्णित कर रहे हैं. supernatant को त्यागें, और PBS के 1 mL के साथ सेल गोली resuspend.
  4. 0.4% ट्रिपैन नीले रंग का उपयोग करके हेमोसाइटोमीटर के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। PBS जोड़कर सेल घनत्व को 1 ×100 μL प्रति 10 6 कोशिकाओं में समायोजित करें। कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।

3. चूहों के वंक्षण क्षेत्र में B16F10-OVA कोशिकाओं के अस्थानिक ट्यूमर आरोपण

  1. 6-8-सप्ताह पुराने C57BL / 6 चूहों का उपयोग करें जो 18-22 ग्राम वजन करते हैं। यादृच्छिककरण या "अंधा" के बिना पुरुष और महिला दोनों का उपयोग करें।
  2. एक 1 mL tuberculin सिरिंज में तैयार B16F10-OVA सेल निलंबन के 100 μL वापस लें। बुलबुले को शीर्ष पर ले जाने के लिए बैरल को टैप करें, और हवा के बुलबुले को हटाने के लिए प्लंजर को धीरे से धक्का दें।
  3. माउस को रोकें और उसके पेट को उजागर करें। बाएं वंक्षण क्षेत्र की त्वचा को कसने के लिए छोटी उंगली से बाएं हिंद पैर को दबाएं।
  4. माउस के बालों को एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ अपने बाएं निचले पेट से हटा दें। बाएं पेट के पीछे के चतुर्थांश को साफ करने के लिए 75% इथेनॉल में भिगोए गए कपास का उपयोग करें।
  5. सिरिंज को एक बहुत ही उथले कोण (0-15 डिग्री) पर पकड़कर सुई के बेवेल के साथ ऊपर की ओर सामना करना पड़ रहा है, इसे बाएं ऊपरी जांघ की साइट पर डालें, और वंक्षण क्षेत्र में चमड़े के नीचे के ऊतक के माध्यम से 0.5-1 सेमी आगे बढ़ें।
  6. इंजेक्शन से पहले प्लंजर पर वापस खींचें। यदि नकारात्मक दबाव है, तो प्लंजर को पूरी तरह से दबाएं, और उप-क्यूटिस में एक छोटे से बोलस (द्रव जेब का गठन) का निरीक्षण करें।
    नोट:: यदि रक्त सुई हब में वापस खींचा जाता है, तो वापस ले लो और किसी अन्य साइट पर पुन: प्रयास करें।
  7. इंजेक्शन लगाने के बाद सुई को हटा दें और इसे उचित रूप से निपटाएं। जारी करें और माउस को पिंजरे में वापस रखें।
  8. B16F10-OVA आरोपण के बाद वर्नियर पैमाने का उपयोग करके 6-8 दिनों में ट्यूमर के आकार को मापें। एक ~ 3 मिमी व्यास (मूंग बीन के आकार) ट्यूमर के साथ चूहों का चयन करें और उन्हें समान रूप से और बेतरतीब ढंग से दो समूहों में विभाजित करें।
    नोट: समान आकार के ट्यूमर वाले चूहों को बेतरतीब ढंग से दाता और प्राप्तकर्ता चूहों के रूप में सौंपा जाता है; दाता चूहों से उत्पादित मिलान ट्यूमर ऊतक प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया जाएगा। इसके अलावा, गैर-संचालित नियंत्रण और शाम-संचालित नियंत्रणों को दत्तक सेल हस्तांतरण पर और चूहों के सामान्य स्वास्थ्य पर सर्जरी के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए। इस प्रकार, ट्यूमर-असर चूहों का एक समूह गैर-संचालित नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, या तो CD45.1 + CD45.2 + या CD45.1 + OT-I कोशिकाओं को प्राप्त करता है लेकिन कोई सर्जरी नहीं होती है। चूहों का दूसरा समूह शाम-संचालित नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, या तो CD45.1 + CD45.2 + या CD45.1 + OT-I कोशिकाओं और बाद की सर्जरी प्रयोगात्मक समूह के समान है, लेकिन कोई एलोग्राफ्ट प्रत्यारोपण नहीं है।

4. ट्यूमर असर चूहों में congenically चिह्नित ओटी-आई टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण

  1. हस्तांतरण से एक दिन पहले, प्रत्येक ट्यूमर-असर माउस के लिए इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से पीबीएस के 200 μL में भंग cyclophosphamide के 4 मिलीग्राम प्रशासित।
    नोट: Cyclophosphamide के साथ उपचार का उद्देश्य मेजबान में लिम्फोपेनिया को प्रेरित करना है जो स्थानांतरित कोशिकाओं के लिए "स्थान" का उत्पादन करता है, उनके अस्तित्व को बढ़ावा देता है और कुशलतासे कार्य करने के लिए लिम्फोइड अंगों को होमिंग करता है।
  2. अलग congenic मार्करों (6-8 सप्ताह पुराने, 18-22 ग्राम, ट्यूमर असर चूहों के रूप में एक ही लिंग) के साथ भोले ओटी-I ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करें। CD45.1 + OT-I चूहों और CD45.1 + CD45.2 + OT-I चूहों का उपयोग करें ताकि ओवीए257-264 एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को क्रमशः ट्यूमर-असर दाता और प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित किया जा सके।
    नोट: दत्तक रूप से स्थानांतरित OT-I कोशिकाओं की उत्पत्ति को आसानी से पहचाना जा सकता है यदि वे अलग-अलग congenic या फ्लोरोसेंट मार्करों को प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, CD45.1+ OT-I T कोशिकाओं को B16F10-OVA-असर दाता चूहों में इंजेक्ट करें, जबकि CD45.1 + CD45.2 + OT-I T कोशिकाओं को B16F10-OVA-असर प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्ट करें। CD45.1 और CD45.2 पैन-लिम्फोसाइट मार्कर CD45 (Ly5) के दोनों आइसोफॉर्म हैं। अन्य आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले कोनजेनिक मार्करों में CD90 (Thy1) के विभिन्न आइसोफोर्म शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न कॉन्जेनिक मार्करों को ले जाने वाले चूहों के लिए किया जा सकता है। ओटी-आई चूहों को अस्वीकृति के मुद्दों से बचने के लिए ओटी-आई सेल ट्रांसफर प्राप्त करने वाले चूहों के रूप में एक ही लिंग का होना चाहिए।
  3. ओटी-आई माउस के प्लीहा और लिम्फ नोड्स से लिम्फोसाइट्स को अलग करें।
    नोट:: इस चरण में निम्न कार्यविधियाँ सख्त asepsis बनाए रखने के लिए एक biosafety कैबिनेट में किया जाना चाहिए।
    1. दो 60 मिमी × 10 मिमी पेट्री व्यंजन तैयार करें। एक डिश में R10 माध्यम के 3 mL जोड़ें, जबकि एक और पकवान में RBL बफर के 3 mL जोड़ें। RBL बफर युक्त पकवान में एक 70 μm नायलॉन सेल छलनी जगह.
    2. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन के बाद एक आइसोफ्लुरेन कक्ष में एक ओटी-आई माउस को Euthanize करें।
    3. माउस के प्लीहा, वंक्षण (subiliac), और एक्सिलरी लिम्फ नोड्स की कटाई करें और उन्हें बर्फ पर R10 के 3 मिलीलीटर के साथ 60 मिमी × 10 मिमी डिश में स्थानांतरित करें।
      नोट: बलिदान किए गए OT-I चूहों की संख्या को स्थानांतरित करने के लिए ट्यूमर-असर वाले चूहों की संख्या के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। ओटी-आई सीडी 8 + टी कोशिकाओं के एक प्लीहा और द्विपक्षीय वंक्षण और एक्सिलरी लिम्फ नोड्स से ओटी-आई सीडी 8 + टी कोशिकाओं की एक विशिष्ट उपज ~ 30-100 × प्रति माउस 106 कोशिकाएं हैं।
    4. एक 1 एमएल सिरिंज के अंत बैरल का उपयोग करते हुए, छलनी के माध्यम से आरबीएल बफर के 3 एमएल में प्लीहा को मैकरेट करें। आरटी पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और ठंडे R10 माध्यम के 3 एमएल जोड़कर प्रतिक्रिया को समाप्त करें।
    5. लिम्फ नोड्स को तब तक मैश करें जब तक कि केवल संयोजी ऊतक न रह जाएं। R10 के साथ फ़िल्टर कुल्ला. सेल निलंबन को एक नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 500 × जी पर सेंट्रीफ्यूज, 6 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    6. Supernatant decant, और MACS बफर के 3 mL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। किसी भी flocs को हटाने के लिए एक नए 70 μm सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पारित करें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 × जी पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant decant.
    8. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, नकारात्मक चयन द्वारा CD8+ T कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए माउस CD8+ T सेल आइसोलेशन किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें.
      नोट: अन्य कंपनियों से किट का उपयोग करते समय, निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    9. शुद्ध सेल निलंबन बर्फ पर रखें। कोशिकाओं का एक छोटा सा नमूना लें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करने के लिए ट्राइपैन नीले रंग के साथ मिलाएं।
  4. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा OT-I (लाइव/डेड-CD8+Va2+) कोशिकाओं का प्रतिशत ज्ञात कीजिये।
    नोट: congenic मार्करों और ट्रांसजेनिक TCR के एक साथ धुंधला हस्तांतरण से पहले कोशिकाओं के सही phenotype सत्यापित करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
    1. 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में FACS बफर के 1 mL में5 × 104-1 × 10 5 कोशिकाओं को जोड़ें, और 350 × g, 3 मिनट के लिए 4 °C पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. supernatant को छोड़ दें, और ट्यूब के नीचे flicking द्वारा कोशिकाओं को तितर-बितर। ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    3. निम्नलिखित संयुग्मित एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें (100 μL FACS बफर में पतला): एंटी-CD8, 1:200; विरोधी TCR Vα2, 1:100; विरोधी CD45.1, 1:200; विरोधी CD45.2, 1:200; और जीवित / मृत, 1: 200 ( सामग्री की तालिका को देखें)।
    4. गोली एंटीबॉडी समुच्चय के लिए 3 मिनट के लिए 15,000 × जी पर एंटीबॉडी कॉकटेल और सेंट्रीफ्यूज भंवर। कॉकटेल को बर्फ पर स्टोर करें और इसे प्रकाश से बचाएं।
    5. एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और ट्यूब को फ्लिक करके पूरी तरह से मिश्रण करें। बर्फ पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
      नोट: ट्यूब के नीचे एंटीबॉडी समुच्चय को परेशान करने से बचें।
    6. FACS बफर के 1 मिलीलीटर के साथ छर्रों को दो बार धोएं। 350 × जी पर सेंट्रीफ्यूज, 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस। FACS बफ़र के 200 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, और सेल निलंबन को FACS ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: स्थानांतरित करने के लिए OT-I कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए, जितनी जल्दी हो सके नमूने का परीक्षण करें। यदि दाग OT-I कोशिकाओं का तुरंत परीक्षण नहीं किया जा सकता है, तो कोशिकाओं को बर्फ पर अंधेरे में रखें या विश्लेषण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रशीतित करें। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को गिरावट को रोकने के लिए विस्तारित भंडारण (16 ज) के लिए 1-4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में फिर से निलंबित किया जा सकता है।
    7. एक प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने को चलाएं। जीवित/मृत-CD8+Vα2+ कोशिकाओं की संख्या को जीवित/मृत-CD8+Vα2+ कोशिकाओं की संख्या को जीवित/मृत कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करके जीवित/मृत-CD8+Va2+ कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना कीजिये।
  5. चरण 4.3.9 में प्राप्त व्यवहार्य सेल संख्या से जीवित/मृत-CD8+Va2+ कोशिकाओं के प्रतिशत को गुणा करके OT-I कोशिकाओं (live/dead-CD8+Va2+) की निरपेक्ष संख्या निर्धारित करें.
  6. OT-I कोशिकाओं (लाइव/डेड-CD8+Va2+) की सांद्रता को PBS के साथ 1.5 × 106 /mL पर समायोजित करें।
  7. पीबीएस के 200 μL में 3 × 105 अलग congenically चिह्नित OT-I कोशिकाओं (लाइव / मृत-CD8 + Va2 +) को B16F10-OVA-असर चूहों के दो समूहों में अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट करें (ट्यूमर-असर वाले चूहों को चरण 3.8 से दाता और प्राप्तकर्ता चूहों में विभाजित किया गया है)।
    1. ओटी-आई सेल (लाइव / डेड-सीडी 8 + वीए 2 +) निलंबन के 200 μL को 100 यू इंसुलिन सिरिंज (29 जी) में वापस लें, और चरण 3.2 के रूप में बुलबुले को हटा दें।
    2. पूंछ नस को फैलाने के लिए माउस को पिंजरे के ऊपर 5-10 मिनट के लिए एक अवरक्त दीपक के साथ एक पिंजरे में अलग से रखें। माउस को उपयुक्त आकार के एक निरोधक उपकरण के साथ स्थिर करें। इसे सीधा करने के लिए पूंछ खींचें और नस को दिखाई देने के लिए 75% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
    3. सिरिंज को शिरा के समानांतर पकड़ें और इसे 0-15 डिग्री के कोण पर नस में डालें। प्लंजर को थोड़ा पीछे खींचें, और यदि रक्त बैरल में प्रवेश करता है, तो धीरे-धीरे और लगातार 1 एमएल / मिनट से अधिक की दर से निलंबन को इंजेक्ट करें।
      नोट: इंजेक्शन साइट पर प्रतिरोध या सूजन इंगित करता है कि सुई नस के अंदर नहीं है; इंजेक्शन साइट को समीपस्थ रूप से स्थानांतरित किया जाना चाहिए।
    4. इंजेक्शन पूरा होने के बाद, सिरिंज को हटा दें, और रक्तस्राव को रोकने के लिए 3-5 सेकंड के लिए सम्मिलन क्षेत्र को धीरे से दबाएं। माउस को पिंजरे में वापस कर दें और प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं के लिए कुछ मिनटों के लिए इसे बारीकी से देखें। यदि इसमें सामान्य गतिशीलता और नाक का निर्वहन है, तो इसे अन्य चूहों की कंपनी में वापस रखें।

5. विच्छेदन ट्यूमर असर दाता चूहों से ट्यूमर द्रव्यमान

नोट: अनुभाग 5 और 6 में सर्जरी के दौरान बाँझ स्थितियों को बनाए रखें। प्रत्येक उपयोग से पहले और बाद में ऑटोक्लेविंग द्वारा सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें। 75% इथेनॉल के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट में ऑपरेटिंग क्षेत्र कीटाणुरहित पराबैंगनी विकिरण के बाद। एक साफ गाउन, टोपी, चेहरे का मुखौटा, और बाँझ दस्ताने पहनें।

  1. दत्तक हस्तांतरण के आठ से दस दिन बाद, प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए ~ 5 मिमी व्यास (सोयाबीन के आकार) के तुलनीय ट्यूमर द्रव्यमान वाले दाता चूहों का चयन करें।
  2. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में 100 मिमी × 20 मिमी पकवान तैयार करें, और बाँझ बर्फ-ठंडे पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद एक isoflurane कक्ष में एक ट्यूमर असर दाता माउस euthanize. माउस को 3-5 मिनट के लिए 75% इथेनॉल में विसर्जित करें और जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें।
    नोट:: इस चरण में निम्न कार्यविधियाँ सख्त asepsis बनाए रखने के लिए एक biosafety कैबिनेट में किया जाना चाहिए।
  4. माउस को एक विच्छेदन बोर्ड पर रखें जो एक सुपाइन स्थिति में साफ अवशोषक कागज के साथ कवर किया गया है। विच्छेदन सुइयों के साथ माउस अंगों को रोकें।
  5. यूरेथ्रल छिद्र के ऊपर से कैंची के साथ xiphoid करने के लिए मध्य रेखा के साथ त्वचा को काटें। चिमटी के साथ माउस शरीर के बाईं ओर त्वचा को खींचें और विच्छेदन सुइयों के साथ त्वचा को नियंत्रित करें।
  6. ट्यूमर को एक्साइज करें, अपने कैप्सूल को यथासंभव बरकरार रखें। ध्यान से और धीरे से सर्जिकल कैंची के साथ ट्यूमर के पास संयोजी ऊतक को हटा दें।
    नोट: ट्यूमर की अखंडता को बनाए रखने के लिए, ट्यूमर कैप्सूल को छीलने या ट्यूमर के ऊतकों को टुकड़ों में न काटें।
  7. ट्यूमर ऊतक को 100 मिमी × 20 मिमी डिश में रखें जिसमें बाद के प्रत्यारोपण के लिए 10 मिलीलीटर बाँझ बर्फ-ठंडा पीबीएस होता है।

6. ट्यूमर मिलान प्राप्तकर्ता चूहों पर दाता व्युत्पन्न ट्यूमर के चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण

नोट: एलोग्राफ्ट को माउस के निचले फ्लैंक में पहले से मौजूद ट्यूमर के रूप में एक ही तरफ प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए ताकि दो ट्यूमर समान लिम्फ नोड में नाली बन सकें। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, जैसा कि बी 16 एफ 10-ओवीए ट्यूमर को माउस (अनुभाग 3) के बाएं वंक्षण क्षेत्र पर चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया गया था, दाता-व्युत्पन्न ट्यूमर ऊतक को इस चरण में प्राप्तकर्ता के बाएं फ्लैंक पर प्रत्यारोपित किया गया था। प्रत्यारोपण साइट को पहले प्रत्यारोपित ट्यूमर साइट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से 2,2,2-tribromoethanol के 250 मिलीग्राम / किग्रा के साथ एक ट्यूमर-मिलान प्राप्तकर्ता माउस को एनेस्थेटाइज़ करें। संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करने के लिए माउस के एक एक्सटेंसर अंग के पैर की अंगुली को पिंच करें और दर्द पलटा की कमी की प्रतीक्षा करें, जो सर्जरी करने के लिए संज्ञाहरण की उचित गहराई को इंगित करता है। यदि vocalization या हिंद अंग वापसी मनाया जाता है, तो आगे 2,2,2-tribromoethanol के 0.01-0.03 mL इंजेक्ट करें।
    नोट: ट्यूमर मिलान प्राप्तकर्ता माउस दाता माउस है कि अस्वीकृति समस्याओं से बचने के लिए allograft प्रदान करता है के रूप में एक ही लिंग होना चाहिए।
  2. सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु मरहम का उपयोग करें। एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ माउस के बाएं फ्लैंक को शेव करें। बचे हुए बालों को हटाने के लिए एक डिपिलेटरी क्रीम लगाएं।
    नोट: त्वचा को घर्षण करने से बचें, जिससे संदूषण और संक्रमण का खतरा बढ़ सकता है।
  3. माउस को जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें। इसे साफ अवशोषक कागज के साथ कवर किए गए विच्छेदन बोर्ड पर प्रवण स्थिति में रखें, जिसमें माउस की ऊर्ध्वाधर धुरी समानांतर है और प्रयोगकर्ता के दाईं ओर इसका सिर है।
    नोट:: इस चरण में निम्न कार्यविधियाँ सख्त asepsis बनाए रखने के लिए एक biosafety कैबिनेट में किया जाना चाहिए।
  4. पोविडोन-आयोडीन में भिगोए गए कपास के साथ शेव किए गए क्षेत्र की त्वचा को रगड़ें।
    नोट: शरीर की गर्मी के नुकसान को रोकने के लिए नसबंदी के लिए 75% इथेनॉल के बजाय पोविडोन-आयोडीन का उपयोग करें।
  5. सर्जिकल चिमटी के साथ माउस कूल्हे जोड़ों के बीच केंद्र बिंदु पर त्वचा को उठाएं। 5 मिमी लंबा ऊर्ध्वाधर उच्छेदन बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। ~ 10-15 मिमी के लिए पृष्ठीय मध्यरेखा के साथ कट rostrally विस्तारित करें।
  6. चीरा में कैंची के बंद युक्तियों को सम्मिलित करके एक तेज विच्छेदन करें और फिर त्वचा और नरम ऊतक से बाएं फ्लैंक के पेरिटोनियम को अलग करने के लिए खोलें।
    नोट: चमड़े के नीचे के ऊतक और पेरिटोनियम को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए, चीरा के केंद्र में त्वचा को उठाएं, और फिर बंद कैंची को यथासंभव त्वचा के करीब डालें।
  7. कई बार तेज विच्छेदन करके बाएं फ्लैंक पर एक त्वचा की जेब बनाएं। कैप्सूल में encapsulated, बरकरार दाता व्युत्पन्न ट्यूमर द्रव्यमान जमा.
    नोट: शाम-संचालित नियंत्रण समूह में चूहों को दाता-व्युत्पन्न ट्यूमर प्रत्यारोपण के बिना एक ही सर्जरी ऑपरेशन प्राप्त होता है।
  8. बाधित टांका द्वारा चीरा बंद करें (सामग्री सूची देखें)। प्रत्येक चीरा के लिए 2-3 टांके रखें। पोविडोन-आयोडीन में भिगोए गए कपास के साथ कट के आसपास की त्वचा को कीटाणुरहित करें।
    नोट: दो लगातार टांके और चीरा से 3 मिमी की दूरी के बीच 5 मिमी होना चाहिए।
  9. माउस को एक साफ और गर्म पिंजरे में पार्श्व स्थिति में रखें। इसे लगातार मॉनिटर करें जब तक कि यह स्टर्नल रिकंबेंसी को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
  10. दर्द को कम करने के लिए सर्जरी के बाद हर 8 घंटे में 0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की खुराक पर चमड़े के नीचे बुखार का प्रशासन करें। माउस के खाने, पीने, आगे बढ़ने की निगरानी करें, और क्षेत्र पर संचालित हो। प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता को पूरी तरह से ठीक होने के बाद ही अन्य जानवरों की कंपनी को वापस करें।
    नोट: माउस आमतौर पर 3 दिनों के भीतर सर्जरी के आघात से ठीक हो जाता है। यदि माउस सामान्य भोजन और गतिशीलता में वापस नहीं आता है और संक्रमण की किसी भी अभिव्यक्तियों को दिखाता है, तो हस्तक्षेप के लिए पशु चिकित्सक से परामर्श करें या इसे euthanize करें।
  11. बलिदान (चरण 4.3.2 के रूप में जानवरों को euthanize) संकेतित समय बिंदुओं पर चूहों, और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए ब्याज की कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल की योजनाबद्धता चित्र 1 में दिखाई गई है। ट्यूमर इनोक्यूलेशन के आठ दिन बाद, CD45.1+ और CD45.1+ CD45.2+ OT-I कोशिकाओं को B16F10-OVA ट्यूमर-असर C57BL /6 चूहों में इंजेक्ट किया गया था। ट्यूमर को शल्य चिकित्सा से CD45.1 + OT-I सेल-प्रत्यारोपित चूहों (दाता) से 8 वें दिन पोस्ट-ट्रांसफर पर विच्छेदित किया गया था और ट्यूमर-मिलान वाले CD45.1 + CD45.2 + OT-I सेल-प्रत्यारोपित चूहों (प्राप्तकर्ता) में प्रत्यारोपित किया गया था, जो प्रत्यारोपित ट्यूमर के रूप में एक ही तरफ पृष्ठीय फ्लैंक में था। फ्लो साइटोमेट्री ( चित्रा 2 में दिखाई गई गेटिंग रणनीति) विश्लेषण के माध्यम से, CD44 + CD8 + ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की दो आबादी को टीएमई में आसानी से पहचाना जा सकता है, जिसमें CD45.1 + दाता-व्युत्पन्न और CD45.1 + CD45.2 + प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न टीआईएल शामिल हैं। इसके बाद, एलोग्राफ्ट के भीतर इन दो आबादी के अनुपात का विश्लेषण एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए संकेतित समय बिंदुओं पर किया गया था। दिन 2 पोस्ट-ट्रांसप्लांटेशन में, ट्रांसप्लांट किए गए ट्यूमर के भीतर दाता-व्युत्पन्न एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का ~ 83% था, जो उनके प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न समकक्षों की तुलना में अधिक प्रमुख था। हालांकि, प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न ओटी-आई कोशिकाओं का अनुपात, दाता से व्युत्पन्न ट्यूमर-अंतर्निहित ओटी-आई कोशिकाओं से अधिक, के देर से चरण में ऊंचा था। (चित्र 3)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक डिजाइन की योजनाबद्ध. C57BL / 6mice वंक्षण क्षेत्र पर B16F10-OVA ट्यूमर के साथ चुनौती दी जाती है। आठ दिन बाद, अलग-अलग congenically चिह्नित (CD45.1+ या CD45.1 + CD45.2 +) OT-I कोशिकाओं को ट्यूमर-असर चूहों में स्थानांतरित कर दिया जाता है। दिन 8 पोस्ट-ट्रांसफर पर, CD45.1 + OT-I सेल-प्रत्यारोपित चूहों पर ट्यूमर को शल्य चिकित्सा से विच्छेदित किया जाता है और ट्यूमर-मिलान CD45.1 + CD45.2 + OT-I सेल-प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ताओं में ट्यूमर-मिलान CD45.1 + CD45.2 + OT-I सेल-प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ताओं में मौजूदा ट्यूमर के रूप में एक ही तरफ फ्लैंक में प्रत्यारोपित किया जाता है। फिर, चूहों को बलिदान किया जाता है, और एलोग्राफ्ट के भीतर एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं (ओटी-आई कोशिकाओं) का विश्लेषण संकेतित समय बिंदुओं पर किया जाता है। संक्षेप: CD = विभेदन का समूह; i.v. = अंतःशिरा; थैली = बलिदान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रवाह cytometry विश्लेषण की गेटिंग रणनीति. गेटिंग रणनीति दाता-व्युत्पन्न (CD45.1+) और प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न (CD45.1+CD45.2+) एंटीजन-विशिष्ट CD44+ CD8+ T कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोग की जाती है। संक्षेप: SSC-A = पक्ष प्रकीर्णन-क्षेत्र; FSC-A = आगे प्रकीर्णन-क्षेत्र; FSC-W = आगे प्रकीर्णन-चौड़ाई; FSC-H = आगे प्रकीर्णन-ऊंचाई; SSC-W = पक्ष प्रकीर्णन-चौड़ाई; SSC-H = साइड स्कैटरिंग-ऊंचाई; L/D = जीवित/मृत; CD = विभेदन का समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ट्यूमर एलोग्राफ्ट के भीतर दाता- और प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का अनुपात। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों congenic मार्करों CD45.1 और CD45.2 की अभिव्यक्ति दिखाने के लिए दाता व्युत्पन्न और प्राप्तकर्ता व्युत्पन्न OT-I कोशिकाओं ट्यूमर allografts के भीतर दिन 2, 8, और 15 प्रत्यारोपण के बाद की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया. संख्याएँ CD44+ CD8+ T सेल जनसंख्या में दो सबसेट के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा ट्यूमर के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जिसमें सीटीएल कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने में अग्रणी भूमिका निभाते हैं। हालांकि, टीएमई के भीतर ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट सीटीएल की उत्पत्ति को स्पष्ट नहीं किया गयाहै। इस ट्यूमर प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल के उपयोग ने एक महत्वपूर्ण सुराग प्रदान किया है कि इंट्राट्यूमरल एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाएं स्टेम-जैसे टीसीएफ 1 + पूर्वज सीडी 8 + टी कोशिकाओं के अस्तित्व के बावजूद लंबे समय तक बनी नहीं रह सकती हैं। विशेष रूप से, ट्यूमर द्रव्यमान में परिधि-व्युत्पन्न ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की निरंतर आमद है।

हमारे ज्ञान के लिए, यह एक अपेक्षाकृत सुविधाजनक और आश्वस्त विधि है जो इस बात की पुष्टि करती है कि टीएमई के भीतर एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का रखरखाव मुख्य रूप से ट्यूमर-निवासी टीआईएल के आत्म-नवीकरण के बजाय परिधि-व्युत्पन्न ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की पुनःपूर्ति पर निर्भर करता है। यद्यपि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल केवल दाता-व्युत्पन्न और प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न टीआईएल के अनुपात पर केंद्रित है, इन दो आबादी के फेनोटाइपिक, कार्यात्मक और ट्रांसक्रिप्शनल गुणों को प्रवाह साइटोमेट्री के साथ आसानी से जांचा जा सकता है। इसके अलावा, आईसीबी थेरेपी के लिए एक विशिष्ट सेल सबसेट की प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए आईसीबी एंटीबॉडी को संयोजित करना संभव है।

इस प्रोटोकॉल में, दाता-व्युत्पन्न ट्यूमर ऊतक को मौजूदा मूल ट्यूमर के साथ प्राप्तकर्ता माउस पर प्रत्यारोपित किया जाता है। एक प्राप्तकर्ता माउस में दो ट्यूमर परिधि-जनित टी कोशिकाओं को दो ट्यूमर द्रव्यमान में वितरित करने के लिए नेतृत्व करेंगे। इसके अलावा, ट्यूमर का बोझ प्रत्यारोपण के बिना जानवरों की तुलना में लगभग दोगुना हो जाएगा। पायलट प्रयोगों में, हमने प्रत्यारोपण से पहले प्राप्तकर्ता चूहों पर मूल ट्यूमर को एक्साइज करने का प्रयास किया; हालांकि, यह तकनीकी रूप से सर्जरी द्वारा सभी ट्यूमर कोशिकाओं को पूरी तरह से खत्म करने के लिए चुनौतीपूर्ण था। अवशिष्ट ट्यूमर कोशिकाएं तेजी से और जल्द ही एक नया ट्यूमर ऊतक का निर्माण करेंगी। इस प्रकार, गैर-प्रत्यारोपित चूहों में उन लोगों के साथ टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की तुलना करते समय इस प्रणाली के लिए एक सीमा है। हालांकि, यह प्रणाली अभी भी हाल ही में माइग्रेट की गई और मौजूदा टी कोशिकाओं की तुलना के लिए उपयोगी है जो एक ही टीएमई के भीतर है जिसे दाता ट्यूमर-असर चूहों से प्रत्यारोपित किया जाता है। इसके अलावा, इस बात से इनकार नहीं किया जा सकता है कि ट्यूमर ऊतक के प्रत्यारोपण से सूजन हो सकती है, जो ट्यूमर के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका गतिशीलता को प्रभावित कर सकती है। हालांकि ओटी-आई सेल घुसपैठ पर सर्जरी के प्रभाव को गैर-संचालित और शाम-संचालित नियंत्रणों के माध्यम से बाहर रखा जा सकता है, हमने ओटी-आई सेल गतिशीलता के लिए स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के प्रभावों का आकलन नहीं किया।

कुछ विचारों को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जिनमें से एक साइक्लोफॉस्फेमाइड का उपयोग है। Cyclophosphamide31 एक alkylating एजेंट व्यापक रूप से ठोस अंग दुर्दमताओं और लिम्फोप्रोलिफेरेटिव और ऑटोइम्यून विकारों के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है। B16F10-OVA इनोक्यूलेशन के छह से आठ दिनों के बाद, साइक्लोफॉस्फेमाइड को मेजबान चूहों के लिम्फोडेपलेशन को प्रेरित करने और स्थानांतरित ओटी-आईकोशिकाओं की गतिविधि को बढ़ाने के लिए दत्तक हस्तांतरण से पहले प्रशासित किया जाता है। यद्यपि मेलेनोमा इस अभिकर्मक के प्रति संवेदनशील नहीं है, कुछ ट्यूमर सेल लाइनें, जैसे कि ईजी 732, एक मुरीन थाइमिक लिम्फोमा सेल लाइन, साइक्लोफॉस्फेमाइड का जवाब देती हैं। Cyclophosphamide के साथ EG7-असर चूहों के उपचार के परिणामस्वरूप ट्यूमर का उन्मूलन होता है, जो बताता है कि cyclophosphamide को संवेदनशील ट्यूमर मॉडल के लिए सावधानीपूर्वक उपयोग या titrated किया जाना चाहिए। अनुशंसित वैकल्पिक विधि स्थानांतरण से एक दिन पहले विकिरण (4.5-5.5 Gy) की एक एकल उप-घातक खुराक है, और इष्टतम विकल्प ट्यूमर सेल लाइनों की विशेषता पर निर्भर करता है।

अन्य कदम सावधानी से उठाए जाने की आवश्यकता है, जिसमें ट्यूमर-असर दाता चूहों का सावधानीपूर्वक चयन और ट्यूमर प्रत्यारोपण के दौरान नाजुक सर्जिकल ऑपरेशन शामिल है। प्रत्यारोपित ट्यूमर को शल्य चिकित्सा से हटा दिया जाएगा और ट्यूमर-मिलान प्राप्तकर्ता चूहों में 8-10 दिनों के बाद स्थानांतरण में प्रत्यारोपित किया जाएगा। प्रत्यारोपण से पहले, ~ 5 मिमी व्यास के ट्यूमर द्रव्यमान का एक तुलनीय आकार व्यक्तिगत चूहों के बीच विसंगतियों को कम करने और अधिग्रहित डेटा को अधिक विश्वसनीय बनाने के लिए एक एलोग्राफ्ट के रूप में चुना जाना है। इसके अलावा, सर्जरी के दौरान, चीरा माउस की मध्यरेखा के पास होना चाहिए ताकि प्राप्तकर्ता माउस में पहले से मौजूद ट्यूमर से दूरी पर एलोग्राफ्ट को रखा जा सके। वंक्षण लिम्फ नोड और आसपास के ऊतकों पर चोटों को रोकने के लिए कोमल विच्छेदन का भी सुझाव दिया जाता है।

कैंसर कोशिकाओं की प्रभावी हत्या के लिए टीएमई33 के भीतर विभिन्न घटकों के समन्वय की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को अनुकूली और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाओं की जांच तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, यहां उपयोग किए जाने वाले B16F10-OVA के अलावा, इस प्रोटोकॉल को अन्य चमड़े के नीचे के ट्यूमर मॉडल पर लागू किया जा सकता है। निष्कर्ष निकालने के लिए, उपर्युक्त ट्यूमर प्रत्यारोपण परख एंटीट्यूमर प्रतिक्रियाओं के दौरान कुछ प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं के इंटरैक्टिव संक्रमण के अध्ययन के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है और ट्यूमर इम्यूनोलॉजी में शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को प्रतिष्ठित युवा विद्वानों के लिए राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान कोष (एलवाई के लिए नंबर 31825011) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (क्यूएच के लिए नंबर 31900643, जेडडब्ल्यू के लिए नंबर 31900656) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Millipore SLGPR33RB
1 mL tuberculin syringe KDL BB000925
1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences 320310
15 mL conical tube BEAVER 43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma T48402-25G
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML
70 μm nylon cell strainer BD Falcon 352350
APC anti-mouse CD45.1 BioLegend 110714 Clone:A20
B16F10-OVA cell line bluefbio BFN607200447
BSA-V (bovine serum albumin) Bioss bs-0292P
BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 BD Horizon 562895 Clone:104
cell culture dish BEAVER 43701/43702/43703
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R
cyclophosphamide Sigma C0768-25G
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco C11995500BT
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19853
EDTA Sigma EDS-500g
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science R510-22-16
KHCO3 Sangon Biotech A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation Life Technologies L10199
needle carrier RWD Life Science F31034-14
NH4Cl Sangon Biotech A501569-0500
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002
surgical forceps RWD Life Science F12005-10
surgical scissors RWD Life Science S12003-09
suture thread RWD Life Science F34004-30
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 172

Erratum

Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 04/29/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.

Step 6.10 of the Protocol was updated from:

Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

to:

Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

चूहों में ट्यूमर-घुसपैठ सीडी 8 <sup>+</sup> टी कोशिकाओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए ट्यूमर प्रत्यारोपण
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