Summary

שיטה פשוטה ליצירת אורגנואידים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Published: April 13, 2021
doi:

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). פרוטוקול זה מייצר אורגנואידים בכליות תוך שבועיים. האורגנואידים של הכליות המתקבלים יכולים להיות מתורבתים בבקבוקי ספינר בקנה מידה גדול או בלוחות ערבוב מגנטיים מרובי בארות עבור גישות מקבילות לבדיקת סמים.

Abstract

אורגנואידים של כליות שנוצרו מ-hPSCs סיפקו מקור בלתי מוגבל של רקמת כליה. אורגנואידים של כליות אנושיות הם כלי רב ערך לחקר מחלות כליות ופציעות, לפיתוח טיפולים מבוססי תאים ולבדיקת טיפולים חדשים. עבור יישומים כאלה, יש צורך במספר רב של אורגנואידים אחידים ומבחנים הניתנים לשחזור. בנינו על פרוטוקול האורגנואידים הכליתי שפורסם בעבר כדי לשפר את הבריאות הכללית של האורגנואידים. פרוטוקול תלת-ממדי פשוט וחזק זה כולל היווצרות של גופים עובריים אחידים במדיום רכיב מינימלי המכיל שומנים, תוסף אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין ואלכוהול פוליוויניל עם מעכב GSK3 (CHIR99021) למשך 3 ימים, ולאחר מכן תרבית במדיום המכיל תחליף סרום נוק-אאוט (KOSR). בנוסף, בדיקות תסיסה מאפשרות הפחתה בהתגוששות של הגוף העוברי ושמירה על גודל אחיד, החשוב לצמצום השונות בין האורגנואידים. בסך הכל, הפרוטוקול מספק שיטה מהירה, יעילה וחסכונית ליצירת כמויות גדולות של אורגנואידים בכליות.

Introduction

בשנים האחרונות פותחו מספר פרוטוקולים להבחנה בין תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידים בכליות 1,2,3,4,5. אורגנואידים של כליות סיפקו כלי חשוב כדי לסייע למחקר בגישות חדשות לרפואה רגנרטיבית, מודל מחלות הקשורות לכליות, ביצוע מחקרי רעילות ופיתוח תרופות טיפוליות. למרות תחולתם הרחבה, לאורגנואידים בכליות יש מגבלות כגון חוסר התבגרות, יכולת תרבית מוגבלת לטווח ארוך במבחנה, ומחסור במספר סוגי תאים המצויים בכליה האנושית 6,7,8. העבודה האחרונה התמקדה בשיפור רמת ההבשלה האורגנואידית, הארכת תקופות התרבית והרחבת המורכבות של אוכלוסיות תאי הכליה על ידי שינוי הפרוטוקולים הקיימים 9,10,11,12. באיטרציה הנוכחית של הפרוטוקול שנקבע עלידינו 5,13, שינינו את הרכיבים הבינוניים בשלב הראשון של הפרוטוקול למדיום בסיס נטול סרום בתוספת אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין (ITSE), שומנים, אלכוהול פוליוויניל (E5-ILP) ו-CHIR99021 (איור 1). שינויים אלה מספקים מדיום מוגדר לחלוטין, נטול סרום ודל חלבון, עם פחות רכיבים מהרכב הבינוני הקודם שלנו 5,13 וללא גורמי גדילה נוספים. כתוצאה מכך, מדיום השלב הראשון הוא פחות עתיר עבודה להכנה מאשר הגרסה שלנו שפורסמה בעבר, ועשוי להפחית את השונות בין אצווה לאצווה5. מחקרים קודמים הראו שגם אינסולין וגם טרנספרין חשובים בתרבית ללא סרום14,15, אולם רמות גבוהות של אינסולין יכולות להיות מעכבות להתמיינות מזודרם16. שמרנו על רמות האינסולין הנמוכות כפי שנקבעו בפרוטוקול המקורי, והפחתנו עוד יותר את רמות ה-KOSR (המכיל אינסולין) בשלב השני של הבדיקה. בהתאם לפרוטוקולים אחרים להיווצרות אורגנואידים בכליות, רמות נמוכות יותר של KOSR מועילות לשמירה על איזון בין התפשטות והתמיינות של רקמת הכליה17. בנוסף, הורדנו את ריכוז הגלוקוז במדיום שלב IIשלנו 13.

השיטה שלנו מתארת התקנה לבדיקת תרחיף של אורגנואידים בכליות, המניבה עד כ-1,000 אורגנואידים מלוח תרבית ראשוני של כ-60% hPSC 100 מ”מ, כפי שתואר בפרסום המקורי 5,13. ניתן לשנות את קנה המידה של פרוטוקול זה בקלות עד כדי התחלה עם מספר לוחות 100 מ”מ או 150 מ”מ כדי להגדיל עוד יותר את מספר האורגנואידים.

Protocol

כל הניסויים באמצעות hPSCs בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, ובוצעו במכסה בטיחות ביולוגית מדרגה II עם ציוד מגן אישי מתאים. כל הריאגנטים הם ברמת תרבית תאים, אלא אם כן צוין אחרת. כל התרבויות מודגרות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% אטמוספירה של אוויר CO2 . בכל שלבי הבדיקה ניתן לאסוף גופים עובריים או…

Representative Results

בגרסה עדכנית זו של הפרוטוקול שלנו, התמיינות אורגנואידית של הכליה מתחילה במדיום מוגדר ודל בחלבון. הבדיקות מבוצעות אך ורק בהשעיה ומסתמכות על היכולת המולדת של התמיינות וארגון hPSCs לייזום טובולוגנזה. בדיקה בודדת שמקורה בצלחת תרבית hPSC של 100 מ”מ כ-60% מניבה באופן שגרתי 500-1,000 אורגנואידים של הכליות, ?…

Discussion

מחקרים קודמים הראו כי שלבי הפרוטוקול הראשוניים הם קריטיים עבורהתמיינות מזודרם ביניים 5,19,20, ולכן חיוני ליישם הרכב בינוני מחמיר בשלב זה. הסרת רכיבים לא מוגדרים כגון סרום, אלבומין, הכלאה נטולת חלבון מדיום II מהשלב הראשון של הפרוטוקול עשויה ל?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 DK069403, UC2 DK126122 ו- P30-DK079307 וקרן ASN לחקר הכליות תוכנית עמיתי המחקר של בן ג’יי ליפס ל- AP.

Materials

2-Mercaptoethanol Thermo Fisher 21-985-023
Anti-adherence rinsing solution STEMCELL Technologies 7010
CHIR99021 STEMCELL Technologies 72054 10 mM stock in DMSO
Corning disposable spinner flasks Fisher Scientific 07-201-152
Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates Fisher Scientific 07-200-601
Corning Slow-Speed Stirrers Fisher Scientific 11-495-03 Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture
Dispase STEMCELL Technologies 7923 Aliquot and freeze
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Thermo Fisher 11054020
DPBS 1x, no calcium, no magnesium Thermo Fisher 14-190-250
Egg / Oval Stirring Bars 2mag PI20106
Excelta General-Purpose Tweezers Fisher Scientific 17-456-103 Keep sterile in the cell culture hood
EZBio Single Use Media Bottle, 250mL Foxx Life Sciences 138-3211-FLS Used to make PVA 10%
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) Thermo Fisher 08-772E
Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL Fisher Scientific 14-955-135
Fisherbrand  Cell Lifters – Cell lifter Fisher Scientific 08-100-240
Fisherbrand Multi Function 3D Rotators Fisher Scientific 88-861-047 Orbital shaker
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher A1413302 BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.
Gentle Cell Dissociation Reagent STEMCELL Technologies 7174 GCDR
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35-050-061 L-glutamine supplement.
HEPES (1M) Thermo Fisher 15-630-080
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine Thermo Fisher 51-500-056 ITSE
KnockOut  Serum Replacement – Multi-Species Thermo Fisher A3181502 KOSR. Aliquot and freeze
Lipid Mixture 1, Chemically Defined Millipore-Sigma L0288-100ML
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher 11140-050
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL Fisher Scientific S2GPU05RE
MilliporeSigma  Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL Fisher Scientific S2GPU02RE
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit 2mag VMF 90250 U
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive 2mag VMF 40600 6MSP
MP Biomedicals  7X Cleaning Solution Fisher Scientific MP0976670A4 Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. 
Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-270
Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-268
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15-140-122 Aliquot and freeze
Plasmocin Invivogen ant-mpt Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze
pluriStrainer® 200 µm Fisher Scientific NC0776417 Cell strainer
pluriStrainer® 500 µm Fisher Scientific NC0822591 Cell strainer
Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed  (PVA) Millipore-Sigma P8136-250G 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS
ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) STEMCELL Technologies 72304 10 mM stock in DPBS
Sterile Disposable Serological Pipets  – 10mL Fisher Scientific 13-678-11E
Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL Fisher Scientific 13-678-11
Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL Fisher Scientific 13-678-12D
TeSR-E5 STEMCELL Technologies 5916 Serum-free, low protein base medium for E5-ILP
Variomag distriBOX 2 Distributor 2mag VMF 90512 If you use more than one MIXdrive

References

  1. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
  3. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  4. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
  5. Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
  6. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  8. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  9. Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
  10. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
  11. Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
  12. Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
  13. Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
  14. Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
  15. Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
  16. Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
  17. Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
  18. Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
  19. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
  20. Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
  21. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  22. Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
  23. Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
  24. Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
  25. Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
  26. Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , (2016).

Play Video

Cite This Article
Przepiorski, A., Crunk, A. E., Holm, T. M., Sander, V., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (170), e62452, doi:10.3791/62452 (2021).

View Video