मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक सरलीकृत विधि
Summary
यहां हम मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) से गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल दो सप्ताह के भीतर गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करता है। परिणामी गुर्दे organoids बड़े पैमाने पर स्पिनर फ्लास्क या समानांतर दवा परीक्षण दृष्टिकोण के लिए बहु अच्छी तरह से चुंबकीय हलचल प्लेटों में सुसंस्कृत किया जा सकता है।
Abstract
एचपीएससी से उत्पन्न गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स ने गुर्दे के ऊतकों का एक असीमित स्रोत प्रदान किया है। मानव गुर्दे organoids गुर्दे की बीमारी और चोट का अध्ययन करने, सेल आधारित उपचार विकसित करने और नए चिकित्सीय परीक्षण के लिए एक अमूल्य उपकरण हैं। इस तरह के अनुप्रयोगों के लिए, बड़ी संख्या में समान ऑर्गेनोइड्स और अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य assays की आवश्यकता होती है। हमने ऑर्गेनोइड्स के समग्र स्वास्थ्य में सुधार करने के लिए अपने पहले से प्रकाशित किडनी ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल पर निर्माण किया है। इस सरल, मजबूत 3 डी प्रोटोकॉल में लिपिड, इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम-एथेनोलामाइन पूरक और जीएसके 3 अवरोधक (CHIR99021) के साथ पॉलीविनाइल अल्कोहल युक्त न्यूनतम घटक माध्यम में समान भ्रूण निकायों का गठन शामिल है, इसके बाद नॉक-आउट सीरम रिप्लेसमेंट (KOSR) में संस्कृति होती है- युक्त माध्यम। इसके अलावा, आंदोलनकारी assays embryoid निकायों के clumping में कमी और एक समान आकार को बनाए रखने के लिए अनुमति देता है, जो organoids के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक तेज़, कुशल और लागत प्रभावी विधि प्रदान करता है।
Introduction
हाल के वर्षों में, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स में अलग करने के लिए कई प्रोटोकॉल 1,2,3,4,5 विकसित किए गए हैं। गुर्दे organoids नए पुनर्योजी चिकित्सा दृष्टिकोण, मॉडल गुर्दे से संबंधित बीमारियों, विषाक्तता अध्ययन और चिकित्सीय दवा के विकास में अनुसंधान में सहायता करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान किया है। उनकी व्यापक प्रयोज्यता के बावजूद, गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स की सीमाएं हैं जैसे परिपक्वता की कमी, विट्रो में सीमित दीर्घकालिक संस्कृति क्षमता, और मानव गुर्दे में पाए जाने वाले कई सेलप्रकारों की कमी 6,7,8। हाल के काम ने ऑर्गेनोइड परिपक्वता के स्तर में सुधार करने, संस्कृति की अवधि का विस्तार करने और मौजूदा प्रोटोकॉल 9,10,11,12 को संशोधित करके गुर्दे की कोशिका आबादी की जटिलता का विस्तार करने पर ध्यान केंद्रित किया है। हमारे स्थापित प्रोटोकॉल 5,13 के इस वर्तमान पुनरावृत्ति में, हमने प्रोटोकॉल के पहले चरण में मध्यम घटकों को सीरम-मुक्त बेस माध्यम में संशोधित किया है, जो इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम-इथेनॉलामाइन (आईटीएसई), लिपिड, पॉलीविनाइल अल्कोहल (ई 5-आईएलपी) और CHIR99021 (चित्रा 1) के साथ पूरक है। ये परिवर्तन एक पूरी तरह से परिभाषित, सीरम-मुक्त, कम-प्रोटीन माध्यम प्रदान करते हैं, जिसमें हमारे पिछले मध्यम संरचना 5,13 की तुलना में कम घटक होते हैं और अतिरिक्त विकास कारकों के बिना। नतीजतन, पहला चरण माध्यम हमारे पहले प्रकाशित संस्करण की तुलना में तैयार करने के लिए कम श्रम-गहन है, और बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलताको कम कर सकता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इंसुलिन और ट्रांसफरिन दोनों सीरम-मुक्त संस्कृति14,15 में महत्वपूर्ण हैं, हालांकि, इंसुलिन का उच्च स्तर मेसोडर्म भेदभाव16 के लिए निरोधात्मक हो सकता है। हमने मूल प्रोटोकॉल में प्रदान किए गए कम इंसुलिन के स्तर को बनाए रखा है, और परख के दूसरे चरण में KOSR (इंसुलिन युक्त) के स्तर को और कम कर दिया है। गुर्दे के ऑर्गेनोइड गठन के लिए अन्य प्रोटोकॉल के अनुरूप, KOSR के निम्न स्तर गुर्दे केऊतकों के प्रसार और भेदभाव के बीच संतुलन बनाए रखने के लिए फायदेमंद हैं। इसके अलावा, हमने अपने चरण II माध्यम13 में ग्लूकोज एकाग्रता को कम कर दिया है।
हमारी विधि गुर्दे organoids के निलंबन परख के लिए एक सेटअप का वर्णन करता है, एक प्रारंभिक ~ 60% confluent hPSC 100 मिमी संस्कृति प्लेट से ~ 1,000 organoids तक उपज के रूप में मूल प्रकाशन 5,13 में वर्णित है. इस प्रोटोकॉल को आसानी से कई 100 मिमी या 150 मिमी प्लेटों के साथ शुरू करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ताकि ऑर्गेनोइड संख्या को और बढ़ाया जा सके।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि प्रारंभिक प्रोटोकॉल चरण मध्यवर्ती मेसोडर्म भेदभाव 5,19,20 के लिए महत्वपूर्ण हैं और इसलिए, इस स्तर पर एक कठोर मध्यम संरचना को लागू करना आव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ R01 DK069403, UC2 DK126122 और P30-DK079307 और ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
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