המאמר מתאר הבחנה מכוונת צעד של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים לאורגנואידים תלת ממדיים שלמים של ריאות המכילים תאי ריאה אפיתל פרוקסימליים ודיסטליים יחד עם מזנכיים.
התפתחות ריאות אנושיות ומחלות כבר קשה ללמוד בשל היעדר רלוונטי ביולוגית במערכות מודל במבחנה . תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs) ניתן להבדיל צעד לתוך organoids ריאות רב תאיים 3D, עשוי הן אוכלוסיות אפיתל ותאים mesenchymal. אנו מסכמים רמזים התפתחותיים עובריים על ידי החדרה זמנית של מגוון גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי ליצור ביעילות אנדודרם סופי, אנדודרם חותם מראש, ולאחר מכן תאי אב ריאה. תאים אלה מוטמעים לאחר מכן בגורם גדילה מופחת (GFR)-מרתף מטריצת ממברנה מדיום, המאפשר להם להתפתח באופן ספונטני לתוך organoids ריאות 3D בתגובה לגורמי גדילה חיצוניים. אלה אורגנוידים ריאות שלם (WLO) לעבור שלבים התפתחותיים ריאות מוקדם כולל מורפוגנזה המסתעפת והתבגרות לאחר חשיפה דקסמתזון, AMP מחזורי ואיזובוטילקסנתין. WLOs מחזיקים בתאי אפיתל דרכי הנשימה המבטאים את הסמנים KRT5 (בזאל), SCGB3A2 (מועדון) ו- MUC5AC (גביע) כמו גם תאי אפיתל מכתשיים המבטאים HOPX (סוג מכתשי I) ו- SP-C (סוג מכתשי II). תאים mesenchymal נוכחים גם, כולל אקטין שריר חלק (SMA), קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם A (PDGFRα). ניתן לשמור על WLOs נגזר iPSC בתנאי תרבות תלת-ממדית במשך חודשים רבים וניתן למיין עבור סמני שטח כדי לטהר אוכלוסיית תאים ספציפית. ניתן להשתמש ב-WLOs שמקורם ב-iPSC גם כדי לחקור את התפתחות הריאות האנושיות, כולל איתות בין אפיתל הריאות למזנשים, כדי לדגמן מוטציות גנטיות על תפקוד והתפתחות תאי הריאה האנושיים, ולקבוע את הציטוקסיות של חומרים מדביקים.
הריאה היא איבר מסובך, הטרוגני ודינמי המתפתח בשישה שלבים נפרדים – התבגרות עוברית, פסאודו-לנדולרית, תעלה, סקוקולרית, מכתשית ומיקרו-וסקולרית1,2. שני השלבים האחרונים מתרחשים לפני ולאחר הלידה בהתפתחות האנושית בעוד ארבעת השלבים הראשונים מתרחשים אך ורק במהלך התפתחות העובר אלא אם כן מתרחשת לידה מוקדמת3. השלב העוברי מתחיל בשכבת הנבט האנדיודרמלי ומסתיים עם ניצני קנה הנשימה וניצני הריאות. התפתחות הריאות מתרחשת בחלקה באמצעות איתות בין התאים האפיתל והמנשימלי4. אינטראקציות אלה גורמות להסתעפות ריאות, התפשטות, קביעת גורל תאי ובידול תאי של הריאה המתפתחת. הריאה מחולקת לאזורי ניצוח (קנה הנשימה לספונכיולים סופניים) ולאזורי נשימה (ברונכיולים נשימתיים אל הנפתים). כל אזור מכיל סוגי תאי אפיתל ייחודיים; כולל תאי בסיס, הפרשה, סילציה, מברשת, נוירואנדוקרינית, ויונוציטים בדרכי הנשימה מוליך5, ואחריו תאי I ו- II מכתשיים באפיתל הנשימה6. הרבה עדיין לא ידוע על ההתפתחות והתגובה לפגיעה של סוגי התאים השונים. מודלים אורגנויד ריאות נגזר iPSC לאפשר מחקר של מנגנונים המניעים את התפתחות הריאות האנושיות, את ההשפעות של מוטציות גנטיות על תפקוד הריאות, ואת התגובה של האפיתל ואת mesenchyme לסוכנים זיהומיים ללא צורך ברקמת ריאה אנושית ראשונית.
סמנים המתאימים לשלבים השונים של בידול עוברי כוללים CXCR4, cKit, FOXA2 ו- SOX17 עבור אנדודרם סופי (DE)7, FOXA2, TBX1 ו- SOX2 עבור אנדודרם נוקב מראש (AFE)8, ו- NKX2-1 עבור תאי אב ריאה מוקדמים9. בהתפתחות הריאות העובריות, הניטור מתחלק לוושט הגחון ולקמה הגחוני. ניצני הריאות הימניות והשמאליות מופיעים כשתי ריאות עצמאיות סביב ניצן קנה הנשימה10. במהלך הסתעפות מורפוגנזה, mesenchyme המקיף את האפיתל מייצר רקמה אלסטית, שריר חלק, סחוס, vasculature11. האינטראקציה בין האפיתל למנשים חיונית להתפתחות תקינה של הריאות. זה כולל את הפרשת FGF1012 על ידי mesenchyme ו SHH13 המיוצר על ידי האפיתל.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידול מכוון של hiPSCs לאורגנואידים תלת ממדיים (3D) ריאות שלמות (WLO). אמנם ישנן גישות דומות המשלבות בידוד של תאי אב ריאה באמצעות מיון בשלב LPC כדי להפוך אורגנוידים דמויי כתשית 14,15 (דיסטליים) או אורגנוידים (פרוקסימליים), או ליצור פרונואידים foregut גחוני-קדמוני כדי להפוך אורגנוידים ריאות אנושיים מבטאים תאי מצוחקים וסמנים mesenchymal ו organoids אב ניצן קצה17 כוחה של שיטה זו הוא הכללת סוגי תאי אפיתל ריאות ומזנכימליים לתבנית ולתזמר מורפוגנזה מסועפת ריאות, התבגרות והתרחבות במבחנה.,
פרוטוקול זה משתמש במולקולות קטנות וגורמי גדילה כדי לכוון את ההבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות אנדודרם מוחלט, אנדודרם חיצוני, ותאי צאצא ריאות. תאים אלה מושרים לאחר מכן לתוך אורגנוידים ריאות שלמות 3D באמצעות צעדים התפתחותיים חשובים, כולל הסתעפות והתבגרות. סיכום פרוטוקול הבידול מוצג באיור 1a עם תמונות ייצוגיות של בידול אנדודרמלי ואורגנויד המוצג באיור 1b. איור 1c,d להראות את פרטי ביטוי הגן של בידול אנדודרמלי, כמו גם את ביטוי הגן של אוכלוסיות פרוקסימליות ודיסטליות של תאי אפיתל ריאות לאחר השלמת ההבחנה.
ההבחנה המוצלחת של אורגנוידים של ריאות שלמים תלת-ממדיים (WLO) מסתמכת על פרוטוקול רב-שלבי בן 6 שבועות עם תשומת לב לפרטים, כולל זמן חשיפה לגורמי גדילה ומולקולות קטנות, צפיפות תאית לאחר המעבר ואיכות hiPSCs. לפתרון בעיות, ראה טבלה 2. hiPSCs צריך להיות כ 70%-80% confluent, עם פחות מ 5% בידול ספונטני לפני ני?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Cell Culture | |||
12 well plates | Corning | 3512 | |
12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
Dispase | StemCellTech | 7913 | |
DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
FBS | Gibco | 10082139 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
Matrigel | Corning | 354230 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
Growth Factors/Small Molecules | |||
Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
EGF | R&D Systems | 236-EG | |
FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
Primary antibodies | Dilution rate | ||
CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |