Génération d’organoïdes pulmonaires entiers 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites pour la modélisation de la biologie et de la maladie du développement pulmonaire
Summary
L’article décrit la différenciation dirigée par étapes des cellules souches pluripotentes induites en organoïdes pulmonaires entiers tridimensionnels contenant à la fois des cellules pulmonaires épithéliales proximales et distales ainsi que du mésenchyme.
Abstract
Le développement et la maladie pulmonaires humaines ont été difficiles à étudier en raison de l’absence de systèmes modèles in vitro biologiquement pertinents. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) peuvent être différenciées progressivement en organoïdes pulmonaires multicellulaires 3D, constitués à la fois de populations de cellules épithéliales et mésenchymateuses. Nous récapitulons les signaux de développement embryonnaire en introduisant temporellement une variété de facteurs de croissance et de petites molécules pour générer efficacement un endoderme définitif, un endoderme de l’intestin antérieur et, par conséquent, des cellules progénitrices pulmonaires. Ces cellules sont ensuite intégrées dans un milieu de matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit (DFG), ce qui leur permet de se développer spontanément en organoïdes pulmonaires 3D en réponse à des facteurs de croissance externes. Ces organoïdes pulmonaires entiers (WLO) subissent des stades précoces de développement pulmonaire, y compris une morphogenèse ramifiée et une maturation après exposition à la dexaméthasone, à l’AMP cyclique et à l’isobutylxanthine. Les WHO possèdent des cellules épithéliales des voies respiratoires exprimant les marqueurs KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) et MUC5AC (gobelet) ainsi que des cellules épithéliales alvéolaires exprimant HOPX (type alvéolaire I) et SP-C (type alvéolaire II). Des cellules mésenchymateuses sont également présentes, notamment de l’actine musculaire lisse (SMA) et du récepteur A du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα). Les WFO dérivés de l’iPSC peuvent être maintenus dans des conditions de culture 3D pendant de nombreux mois et peuvent être triés pour les marqueurs de surface afin de purifier une population cellulaire spécifique. Les WFO dérivés de l’iPSC peuvent également être utilisés pour étudier le développement pulmonaire humain, y compris la signalisation entre l’épithélium pulmonaire et le mésenchyme, pour modéliser les mutations génétiques sur la fonction et le développement des cellules pulmonaires humaines et pour déterminer la cytotoxicité des agents infectieux.
Introduction
Le poumon est un organe compliqué, hétérogène et dynamique qui se développe en six stades distincts – maturation embryonnaire, pseudoglandulaire, canaliculaire, sacculaire, alvéolaire et microvasculaire1,2. Les deux dernières phases se produisent avant et après la naissance dans le développement humain, tandis que les quatre premières étapes se produisent exclusivement pendant le développement du fœtus, à moins qu’une naissance prématurée ne se produise3. La phase embryonnaire commence dans la couche germinale endodermique et se termine par le bourgeonnement de la trachée et des bourgeons pulmonaires. Le développement pulmonaire se produit en partie par signalisation entre les cellules épithéliales et mésenchymateuses4. Ces interactions entraînent la ramification pulmonaire, la prolifération, la détermination du devenir cellulaire et la différenciation cellulaire du poumon en développement. Le poumon est divisé en zones conductrices (trachée aux bronchioles terminales) et zones respiratoires (bronchioles respiratoires aux alvéoles). Chaque zone contient des types uniques de cellules épithéliales; y compris les cellules basales, sécrétoires, ciliées, de brosse, neuroendocrines et ionocytaires dans les voies respiratoires conductrices5, suivies des cellules alvéolaires de type I et II dans l’épithélium respiratoire6. On ignore encore beaucoup de choses sur le développement et la réponse aux blessures des différents types de cellules. Les modèles d’organoïdes pulmonaires dérivés de la CSPi permettent d’étudier les mécanismes qui stimulent le développement pulmonaire humain, les effets des mutations génétiques sur la fonction pulmonaire et la réponse de l’épithélium et du mésenchyme aux agents infectieux sans avoir besoin de tissu pulmonaire humain primaire.
Les marqueurs correspondant aux différents stades de la différenciation embryonnaire comprennent CXCR4, cKit, FOXA2 et SOX17 pour l’endoderme définitif (DE)7, FOXA2, TBX1 et SOX2 pour l’endoderme antérieur de l’intestin antérieur (AFE)8, et NKX2-1 pour les cellules progénitrices pulmonaires précoces9. Dans le développement pulmonaire embryonnaire, l’intestin antérieur se divise en œsophage dorsal et trachée ventrale. Les bourgeons des poumons droit et gauche apparaissent comme deux outpouchings indépendants autour du bourgeon trachéal10. Au cours de la morphogenèse ramifiée, le mésenchyme entourant l’épithélium produit du tissu élastique, du muscle lisse, du cartilage et du système vasculaire11. L’interaction entre l’épithélium et le mésenchyme est essentielle au développement normal des poumons. Cela inclut la sécrétion de FGF1012 par le mésenchyme et de SHH13 produit par l’épithélium.
Ici, nous décrivons un protocole pour la différenciation dirigée des hiPSC en organoïdes pulmonaires entiers (WLO) tridimensionnels (3D). Bien qu’il existe des approches similaires qui intègrent l’isolement des cellules progénitrices pulmonaires par tri au stade LPC pour fabriquer des organoïdes alvéolaires14,15 (distaux) ou des organoïdes des voies respiratoires16 (proximaux), ou génèrent des sphéroïdes ventraux-antérieurs de l’intestin antérieur pour fabriquer des organoïdes pulmonaires humains exprimant des marqueurs alvéolaires et mésenchymateux et des organoïdes progénitrices de la pointe des bourgeons17 , la force de cette méthode est l’inclusion des deux types de cellules épithéliales et mésenchymateuses pulmonaires pour modéliser et orchestrer la morphogenèse, la maturation et l’expansion des ramifications pulmonaires in vitro.
Ce protocole utilise de petites molécules et des facteurs de croissance pour diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes à travers l’endoderme définitif, l’endoderme de l’intestin antérieur et les cellules progénitrices pulmonaires. Ces cellules sont ensuite induites en organoïdes pulmonaires entiers 3D à travers des étapes de développement importantes, y compris la ramification et la maturation. Le résumé du protocole de différenciation est illustré à la figure 1a avec des images représentatives en champ clair de la différenciation endodermique et organoïde illustrées à la figure 1b. La figure 1c,d montre les détails de l’expression génique de la différenciation endodermique ainsi que l’expression génique des populations proximales et distales des cellules épithéliales pulmonaires après avoir terminé la différenciation.
Protocol
Representative Results
Discussion
La différenciation réussie des organoïdes pulmonaires entiers (WLO) 3D repose sur un protocole en plusieurs étapes de 6 semaines avec une attention aux détails, y compris le temps d’exposition aux facteurs de croissance et aux petites molécules, la densité cellulaire après le passage et la qualité des hiPSC. Pour le dépannage, reportez-vous au Tableau 2. Les csahah doivent être confluents à environ 70 % à 80 %, avec moins de 5 % de différenciation spontanée avant la dissociation. Ce prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
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